Moleculaire genetica jaar 2 de colleges
COLLEGE 1
Klassieke genetica: van fenotype naar gen
Mendel: paren contrasterende eigenschappen komen voort uit een factor
die alternatieve vormen heeft. Geen vermenging; ouders dragen elk een
factor over. Deze factoren zijn genen en de alternatieve vormen zijn
verschillende vormen van een gen = allelen. De wetten van Mendel:
1. Erfelijke eigenschappen worden bepaald door genen, die hun
identiteit behouden in een hybride.
2. Eén vorm van een gen (allel) kan dominant zijn over een ander,
recessief allel.
3. Elk volwassen organisme heeft twee kopieën van elk gen. De
geslachtscellen krijgen één van de kopieën.
4. a. Verschillende allelen van een gen erven onafhankelijk over.
b. Allelen van verschillende genen erven onafhankelijk over.
Ook Darwin zag zoiets met verschillende verhoudingen. Selectie van
organismen die – via een kansproces (mutaties) – zich het beste
aanpassen aan hun natuurlijk omgeving.
Hij had ook een theorie over overerven: eigenschappen van ouders
worden gemengd in hun nakomelingen. Deze theorie heette pangenese:
cellen scheiden gemmules af, die zich door het lichaam verspreiden en in
geslachtscellen verzamelen en via deze cellen overerven. Elke cel heeft
dus een ‘stem’ in de samenstelling van het nageslacht. Dit klopt niet,
maar zou nog verklaard kunnen worden door epigenetische veranderingen
die je tijdens het leven oploopt en via je gameten doorgeeft.
Klassieke genetica naar moleculaire genetica
Kleuringen van chromosomen. Genen bleken een deel van een
chromosoom, met de verschillende allelen op verschillende chromosomen.
Er zijn ook afwijkingen gevonden op de wetten van Mendel: zo vindt er
toch soms een koppeling plaats van twee genen, dit komt door de kleine
afstand van de twee genen op een chromosoom. Maar ook deze genen
kunnen gesplitst worden = recombinatie.
Een andere afwijking is polyploïdie (niet alles dus twee kopieën).
In 1944/1950 werd ontdekt dat DNA drager is van het genetisch materiaal.
In 1953 is de structuur van het DNA bekend geworden. In 1961 de
genetische code ontrafeld.
De definitie van een gen: een DNA segment wat in een functioneel RNA
molecuul wordt overgeschreven. Dit RNA hoeft geen mRNA te zijn, RNA op
zichzelf kan ook een functie hebben, zoals ribosomaal RNA.
Bij zo’n gen horen de volgende onderdelen: promotor, exonen en intronen
(exon komt in mRNA terecht en intronen worden eruit gespliced).
Transcriptie wordt gereguleerd bij de promotor. De promotor is het gebied
waar algemene transcriptiefactoren en de RNA-polymerase II binden. De
TATA-box is waar de algemene transcriptiefactoren binden, onderdeel van
de promotor. RNA-polymerase II wordt gebruikt voor het afschrijven van
mRNA. De ‘gene control region’ alle elementen die effect hebben op de
hoeveelheid transcript per tijdseenheid. In de ‘gene control region’ zitten
ook andere elementen die effect hebben op transcriptie. Zo zijn er
,regulatory sequences: daar moet een eiwit aanbinden, als dit zorgt voor
meer transcriptie is dit een
‘enhancer’ en als dit zorgt
voor minder transciptie is
dit een ‘silencer’. Een
mediator is een heel groot
eiwitcomplex (deels
transcriptiefactoren, veel
componenten) en de
compositie is afhankelijk
van het gen. Deze mediator
integreert alle factoren die
effect hebben op de
transcriptie.
In de kern zitten aparte
plekken voor transcriptie,
daar zijn bijvoorbeeld veel transcriptiefactoren aanwezig.
Mutaties: elke verandering de basenpaarvolgorde van het DNA. Dit zijn
verschillende voorbeelden:
Enkele basepaarverandering
Transitie: G-C naar A-T (pur pur of pyr pyr)
Transversie: G-C naar T-A of G-C naar C-G (pur pyr)
Inserties
Deleties
Herschikking/duplicatie
Verschillende oorzaken van natuurlijke (spontane mutaties):
Replicatiefouten (gebeurt heel weinig, door proof reading)
UV/radioactieve straling
Mobiele genetische elementen: transposons en virussen
Geïnduceerde mutaties, voorbeelden:
Chemisch: ethyl methaansulfonaat (EMS): G-C naar A-T transities
Ioniserende straling (gamma/röntgen): deleties/breuken
Inserties: transposons + transformatie (vreemd DNA)
Type mutaties aan de promotor zijn: inserties en deleties (door DNA
inserties, door EMS subtiele mutaties en door bestraling deleties). Aan het
intron zijn splice sites en inserties. Aan de coderende regio
inserties/deleties, daardoor frameshift, nonsense en missense mutatie.
COLLEGE 2
Genetische modificatie: kunstmatig veranderen van het genoom van een
organisme op een manier die door voortplanting of natuurlijke
recombinatie niet mogelijk is. Cisgenese: het inbrengen van genen van
dezelfde soort en transgenese: het inbrengen van genen van een andere
soort. GGO: genetisch gemodificeerd organisme, verkregen door
introductie RNA of DNA.
, Conventionele veredeling: naast de standaard kruisingen binnen de soort
heb je ook hybridisatie. Dit kan binnen een familie, en ook tussen families
(dit heet brede hybridisatie). Naast hybridisatie ook mutagenese.
Toepassingen van genetische modificatie:
Wetenschappelijk onderzoek
Gewasverbetering (opbrengst, eiwitten, voedingswaarde en
medicijnen)
Gewasbescherming (resistentie tegen plagen, bestrijdingsmiddelen)
Cosmetische aanpassingen (bloemkleur, bladvorm)
Transgeen organisme in drie stappen:
Introductie van DNA in de cel. Dit kan op verschillende manieren:
met een injectienaald, met een projectielpistool, via een virus en via
een transformatie. Een andere manier is via het gebruik van
Argobacterium (zie onder).
Insertie in het chromosomaal DNA. Deze insertie kan niet-homologe
recombinatie zijn (NHR) en homologe recombinatie (HR), met behulp
van een target locus.
Regeneratie van een heel organisme uit de transgene cel. Dit kan op
verschillende manieren: via weefselkweek (sturing met
planthormonen en selectie antibioticum/herbicide), via floral dip
(transformatieprocedure zonder regeneratie). In dieren gaat de
regeneratie anders: een gemodificeerde stamcel in een embryo, dan
dus nakomelingen deels transgeen en deels niet. Pas nakomelingen
van volgende generatie 100% transgeen. Let op, wel als in eerste
generatie de ES cellen in de geslachtscellen zijn.
Argobacterium t-DNA transfer. In de Ti plasmide zitten auxine en
cytokinine genen, hier heeft de bacterie niets aan, en dit komt pas in
expressie in de plant 9eukaryote promotor). De Ti plasmide bestaat uit een
onc-gen en een RB en LB: dit zijn de linker en rechter border repeat. Ook
E: enhancer sequentie/overdrive. Daarnaast zit op de Ti-plasmide ook een
vir-region. Pas handig als je de T-regio modificeert en niet de onc-genen
maar ander DNA tussen de RB en LB zet. In Leiden is het binaire
vectorsysteem geintroduceerd: niet een Ti-plasmide met T en vir regio,
maar twee kleinere plasmides. Een binaire plasmide met T regio en een
‘disarmed’ Ti plasmide met een vir regio.
Het mechanisme van T-DNA transfer:
1. Het mechanisme wordt pas in gang gezet als de plant beschadigd is.
Dan reageert de plant op acetosyrington: vir A is hiervoor de sensor.
Vir A fosforyleert dan vir G en deze is dan belangrijk voor de
expressie van het vir operon.
2. Productie van de T-streng, dit gebeurt ook onder invloed van vir D1
en vir D2. Zie afbeelding hiernaast.
3. De overdracht van het T-complex en eiwitten. De T-streng met
daaraan het vir D2 eiwit eraan gaat door de T-pilus (Type 4 Secretion
System). Daarna komen er nog extra eiwitten aan en zo gaat hij de
kern in.
Vergelijking vreemd DNA
Zuiver DNA Agrobacterium
Kopieaantal Veel Weinig
COLLEGE 1
Klassieke genetica: van fenotype naar gen
Mendel: paren contrasterende eigenschappen komen voort uit een factor
die alternatieve vormen heeft. Geen vermenging; ouders dragen elk een
factor over. Deze factoren zijn genen en de alternatieve vormen zijn
verschillende vormen van een gen = allelen. De wetten van Mendel:
1. Erfelijke eigenschappen worden bepaald door genen, die hun
identiteit behouden in een hybride.
2. Eén vorm van een gen (allel) kan dominant zijn over een ander,
recessief allel.
3. Elk volwassen organisme heeft twee kopieën van elk gen. De
geslachtscellen krijgen één van de kopieën.
4. a. Verschillende allelen van een gen erven onafhankelijk over.
b. Allelen van verschillende genen erven onafhankelijk over.
Ook Darwin zag zoiets met verschillende verhoudingen. Selectie van
organismen die – via een kansproces (mutaties) – zich het beste
aanpassen aan hun natuurlijk omgeving.
Hij had ook een theorie over overerven: eigenschappen van ouders
worden gemengd in hun nakomelingen. Deze theorie heette pangenese:
cellen scheiden gemmules af, die zich door het lichaam verspreiden en in
geslachtscellen verzamelen en via deze cellen overerven. Elke cel heeft
dus een ‘stem’ in de samenstelling van het nageslacht. Dit klopt niet,
maar zou nog verklaard kunnen worden door epigenetische veranderingen
die je tijdens het leven oploopt en via je gameten doorgeeft.
Klassieke genetica naar moleculaire genetica
Kleuringen van chromosomen. Genen bleken een deel van een
chromosoom, met de verschillende allelen op verschillende chromosomen.
Er zijn ook afwijkingen gevonden op de wetten van Mendel: zo vindt er
toch soms een koppeling plaats van twee genen, dit komt door de kleine
afstand van de twee genen op een chromosoom. Maar ook deze genen
kunnen gesplitst worden = recombinatie.
Een andere afwijking is polyploïdie (niet alles dus twee kopieën).
In 1944/1950 werd ontdekt dat DNA drager is van het genetisch materiaal.
In 1953 is de structuur van het DNA bekend geworden. In 1961 de
genetische code ontrafeld.
De definitie van een gen: een DNA segment wat in een functioneel RNA
molecuul wordt overgeschreven. Dit RNA hoeft geen mRNA te zijn, RNA op
zichzelf kan ook een functie hebben, zoals ribosomaal RNA.
Bij zo’n gen horen de volgende onderdelen: promotor, exonen en intronen
(exon komt in mRNA terecht en intronen worden eruit gespliced).
Transcriptie wordt gereguleerd bij de promotor. De promotor is het gebied
waar algemene transcriptiefactoren en de RNA-polymerase II binden. De
TATA-box is waar de algemene transcriptiefactoren binden, onderdeel van
de promotor. RNA-polymerase II wordt gebruikt voor het afschrijven van
mRNA. De ‘gene control region’ alle elementen die effect hebben op de
hoeveelheid transcript per tijdseenheid. In de ‘gene control region’ zitten
ook andere elementen die effect hebben op transcriptie. Zo zijn er
,regulatory sequences: daar moet een eiwit aanbinden, als dit zorgt voor
meer transcriptie is dit een
‘enhancer’ en als dit zorgt
voor minder transciptie is
dit een ‘silencer’. Een
mediator is een heel groot
eiwitcomplex (deels
transcriptiefactoren, veel
componenten) en de
compositie is afhankelijk
van het gen. Deze mediator
integreert alle factoren die
effect hebben op de
transcriptie.
In de kern zitten aparte
plekken voor transcriptie,
daar zijn bijvoorbeeld veel transcriptiefactoren aanwezig.
Mutaties: elke verandering de basenpaarvolgorde van het DNA. Dit zijn
verschillende voorbeelden:
Enkele basepaarverandering
Transitie: G-C naar A-T (pur pur of pyr pyr)
Transversie: G-C naar T-A of G-C naar C-G (pur pyr)
Inserties
Deleties
Herschikking/duplicatie
Verschillende oorzaken van natuurlijke (spontane mutaties):
Replicatiefouten (gebeurt heel weinig, door proof reading)
UV/radioactieve straling
Mobiele genetische elementen: transposons en virussen
Geïnduceerde mutaties, voorbeelden:
Chemisch: ethyl methaansulfonaat (EMS): G-C naar A-T transities
Ioniserende straling (gamma/röntgen): deleties/breuken
Inserties: transposons + transformatie (vreemd DNA)
Type mutaties aan de promotor zijn: inserties en deleties (door DNA
inserties, door EMS subtiele mutaties en door bestraling deleties). Aan het
intron zijn splice sites en inserties. Aan de coderende regio
inserties/deleties, daardoor frameshift, nonsense en missense mutatie.
COLLEGE 2
Genetische modificatie: kunstmatig veranderen van het genoom van een
organisme op een manier die door voortplanting of natuurlijke
recombinatie niet mogelijk is. Cisgenese: het inbrengen van genen van
dezelfde soort en transgenese: het inbrengen van genen van een andere
soort. GGO: genetisch gemodificeerd organisme, verkregen door
introductie RNA of DNA.
, Conventionele veredeling: naast de standaard kruisingen binnen de soort
heb je ook hybridisatie. Dit kan binnen een familie, en ook tussen families
(dit heet brede hybridisatie). Naast hybridisatie ook mutagenese.
Toepassingen van genetische modificatie:
Wetenschappelijk onderzoek
Gewasverbetering (opbrengst, eiwitten, voedingswaarde en
medicijnen)
Gewasbescherming (resistentie tegen plagen, bestrijdingsmiddelen)
Cosmetische aanpassingen (bloemkleur, bladvorm)
Transgeen organisme in drie stappen:
Introductie van DNA in de cel. Dit kan op verschillende manieren:
met een injectienaald, met een projectielpistool, via een virus en via
een transformatie. Een andere manier is via het gebruik van
Argobacterium (zie onder).
Insertie in het chromosomaal DNA. Deze insertie kan niet-homologe
recombinatie zijn (NHR) en homologe recombinatie (HR), met behulp
van een target locus.
Regeneratie van een heel organisme uit de transgene cel. Dit kan op
verschillende manieren: via weefselkweek (sturing met
planthormonen en selectie antibioticum/herbicide), via floral dip
(transformatieprocedure zonder regeneratie). In dieren gaat de
regeneratie anders: een gemodificeerde stamcel in een embryo, dan
dus nakomelingen deels transgeen en deels niet. Pas nakomelingen
van volgende generatie 100% transgeen. Let op, wel als in eerste
generatie de ES cellen in de geslachtscellen zijn.
Argobacterium t-DNA transfer. In de Ti plasmide zitten auxine en
cytokinine genen, hier heeft de bacterie niets aan, en dit komt pas in
expressie in de plant 9eukaryote promotor). De Ti plasmide bestaat uit een
onc-gen en een RB en LB: dit zijn de linker en rechter border repeat. Ook
E: enhancer sequentie/overdrive. Daarnaast zit op de Ti-plasmide ook een
vir-region. Pas handig als je de T-regio modificeert en niet de onc-genen
maar ander DNA tussen de RB en LB zet. In Leiden is het binaire
vectorsysteem geintroduceerd: niet een Ti-plasmide met T en vir regio,
maar twee kleinere plasmides. Een binaire plasmide met T regio en een
‘disarmed’ Ti plasmide met een vir regio.
Het mechanisme van T-DNA transfer:
1. Het mechanisme wordt pas in gang gezet als de plant beschadigd is.
Dan reageert de plant op acetosyrington: vir A is hiervoor de sensor.
Vir A fosforyleert dan vir G en deze is dan belangrijk voor de
expressie van het vir operon.
2. Productie van de T-streng, dit gebeurt ook onder invloed van vir D1
en vir D2. Zie afbeelding hiernaast.
3. De overdracht van het T-complex en eiwitten. De T-streng met
daaraan het vir D2 eiwit eraan gaat door de T-pilus (Type 4 Secretion
System). Daarna komen er nog extra eiwitten aan en zo gaat hij de
kern in.
Vergelijking vreemd DNA
Zuiver DNA Agrobacterium
Kopieaantal Veel Weinig
