MENSELIJKE GENETICA
HOOFDSTUK 6: PRINCIPES VAN GEN REGULATIE EN EPIGENETICA
GENETISCHE REGULATIE
CIS EN TRANS ACTING GENREGULATIE
Regulatie van genexpressie gebeurt aan de hand van cis en trans acting regulatie:
- Cis acting regulatie op DNA niveau
= een DNA sequentie die reguleert op zijn eigen DNA streng
o Regulatorische sequenties: promotors en enhancers / silencers
o Reguleert altijd 1 gen: 1 allel
- Trans acting regulatie
= een RNA of eiwit dat migreert door diffusie, reguleert op afstand. Bv. een transcriptiefactor
o Bindt op een regulatorisch element (korte DNA sequentie)
o Reguleert beide alleleln van een gen en kan meerdere genen tegelijk reguleren
Regulatie is uiteindelijk altijd een combinatie van cis en trans
- Enhancer (cis) en transcriptiefactor (trans) die erop bindt
- miRNA bindende sequentie (cis) en miRNA (trans) dat erop bindt
CIS ACTING ELEMENTEN IN RNA
Cis-acting RNA sequenties reguleren enkel het RNA transcript waarop het gelegen is. Ze liggen vaak in de niet-
getranslationeerde regio’s van het mRNA: 5’ en 3’ UTRs (untranslated regions). Deze worden dan gebonden door trans
activerende eiwitten en miRNA’s. Het is veel voorkomend, vooral de miRNA binding op de 3’ UTR.
In deze afbeelding wordt de expressie van gen A
gereguleerd door de trans-acting regulatoire
proteïne X en door microRNA Y, die beiden binden
aan de cis-acting elementen in de 5’ en 3’ UTR van
het mRNA.
GENETISCHE REGULATOREN VAN GENEXPRESSIE
PROMOTOR: DE AAN/UIT KNOP VAN GENEN
= cis-acting. De promotor is belangrijk bij de bepaling welke gensegmenten vd DNA streng transcriptie ondergaan.
RNA polymerase II: schrijft eiwit coderende genen af (long-non coding RNA’s en miRNA’s).
- vormt een groot transcriptie initiatie complex met algemene transcriptiefactoren
- vormt zich op (cis acting) consensus sequenties in de buurt van de transcriptie startplaats: de promotor
RNA polymerase I schrijft de meeste ribosomale RNA’s af en RNA polymerase III schrijft tRNA genen, één ribosomaal
RNA en sommige kleine RNA’s af.
Dit is een gemiddelde promotor met een aantal sequenties. Niet elke promotor bevat al deze sequenties: geen ervan is
nodig noch voldoende voor promotor activiteit. Er zijn zelfs promotors met geen van deze elementen. De RNA
polymerase II promotor bevat typisch:
, 1. BRE: TF-II-B recognition element: hierop kan transcriptiefactor II B binden.
2. TATA box
3. Inr: initiator element (A is de transcriptiestartplaats)
4. DPE: downstream core promotor element
ENHANCERS, SILENCERS, BOUNDARIES, INSULATORS
= cis-acting sequenties van typisch 4-9 bp. Bevinden zich zowel upstream als downstream van de promotor, vaak
binnen de 1,5 kb maar ook vaak veel verder.
- Enhancers versterken expressie
o Zitten meestal op kleinere afstand, maar soms ook veel bp verwijderd van het in te werken gen
o Bv. PAX6 gen wordt gereguleerd door een enhancer op grote afstand
- Silencers onderdrukken expressie
- Boundary sequenties:
o Insulators: blokkeren interactie tss enhancer en promotor door regulatorische elementen te binden
o Barrière elementen tussen euchromatine en heterochromatine
Er is een groot verschil tussen epigenetische en genetische boundary sequenties
TADS: TOPOLOGICALLY ASSOCIATING DOMAINS
Genoom bestaat uit blokjes van genen en enhancers die enkel
werken op genen in dat blokje. Tussen de blokjes zitten boundaries:
bepalen tot op welke genen enhancers kunnen inwerken.
- = genomische regio die promotor interacties limiteert, afgebakend door boundaries
- Evolutionair geconserveerd tussen species
- Verklaren hoe deleties en inversie nabijgelegen genen buiten de deletie of inversie kunnen beïnvloeden
TADs zijn lange stukken DNA met op het einde een hogere concentratie CTCF (CCTCT binding factor). Dit is een
insulator eiwit dat samen met cohesines de TAD zal afbakenen.
Bij syndactelie zijn de vingers samengegroeid bij de geboorte
door een inversie. Door deze inversie zullen een aantal
regulatorische elementen (enhancers en silencers) uit de groene,
in de oranje blok komen. Er gaan geen DNA verloren maar er
wordt een boundarie verplaatst waardoor sommige genen nu wel
of juist niet tot expressie komen. Dit kan ook bij bv. een deletie
van een boundary (bv. bij ADLD)
TRANSCRIPTIEFACTOREN
= DNA bindende eiwitten. Ze binden op cis-acting sequenties.
- Combinatorial: verschillende transcriptiefactoren binden tegelijkertijd
- Co-activatoren en co-repressoren
o Moduleren de actie van TF zonder dat ze DNA binden
o Werken via eiwit-eiwit interacties met regulatorische eiwitten
Transcriptiefactoren herkennen en binden DNA sequenties op specifieke plaatsen in het DNA om het effect op de
genregulatie uit te voeren. Er zijn 2 verschillende DNA bindende motieven:
,Zinc finger: 2 cys en 2 his. Hebben een 3D structuur die in de grote groeve van het DNA gaat ‘voelen’ als een
vinger, welke DNA sequentie het is. Het is een AZ sequentie die DNA sequenties kan aflezen. Er zijn versch
types om zo spec. sequenties te kunnen herkennen (in vitro maken voor specifieke sequenties).
Leucine zipper: een α-helix van 2 peptides die Leu hebben in elke draai van de helix. Zo komen
leucines op 2 rijtjes die in elkaar in grijpen tot α-helix. De peptides zijn langer en er zijn verdere
sequenties die ook in de groeve van de DNA molecule zal passen. Dit is als een wasknijper die op het DNA
zit, die ook de DNA sequentie kan herkennen.
SPLICING
Splice regions = geconserveerde sequenties op de overgangen tussen exonen en intronen.
1e keer geknipt op de splice donor: lassostructuur gemaakt doordat splice donor
sequentie wordt gebonden op de branch site. Er wordt een 2e keer geknipt op de
splice acceptor: intron verdwijnt en wordt afgebroken, exonen worden aan elkaar gezet.
Er zijn nog sequenties (cis-acting regulatorische RNA elementen) die splicing beïnvloeden.
Deze kunnen gelegen zijn in exonen of in intronen en kunnen enhancers zijn of suppressors.
− In exon gelegen → exonic splice enhancers ESE of exonic splice silencers ESS
− In intron gelegen → intronic splice enhancer ISS of intronic splice silencer ISE
Soms kunnen ze tegelijk inwerken op verschillende splice sites. Daarnaast kunnen ze zorgen voor alternatieve splicing
doordat het exon bv. een stukje korter wordt gemaakt of het intron een stukje korter.
Alternatieve splicing
= variatie in intron-exon junctions door:
- Gebruik van alternatieve splice donors (B) of acceptors (C)
- Exon skipping (D) - Alternatieve exonen (E)
De verschillende transcripten worden isovormen genoemd, vaak zijn er specifieke
transcripten per weefsel of voor bepaalde ontwikkelingsstadia. Ook zijn er vaak
verschillende isovormen voor de cellulaire compartimenten of voor secretie.
Er kunnen ook facultatieve exonen zijn: soms gebruikt en soms niet. Deze bevatten dan
vaak een eiwit domein dat in sommige weefsels wel gewenst is en in sommige weefsels niet.
Alternatieve splicing voor het CDKN2A gen
= een beetje een buitenbeentje in het genoom. Het is het enige gen in het genoom waar we overlappende genen
hebben: 2 genen bovenop elkaar maar in een ander leesraam. Het produceert op deze manier twee verschillende
tumor suppressor genen (P14 en P16 eiwit). De ene AZ zitten in een leesraam en de andere in een ander leesraam.
Komt veel voor bij virussen: genen coderen op een compacte manier in een kleiner genoom. Nadeel: 1 puntmutatie
zou kunnen zorgen voor uitval / mutatie van 2 genen
, REGULATIE VAN IJZER (FE) OPNAME TRANS-ACTING REGULATORISCH EIWIT
Fe is een belangrijk ion en cofactor, maar kan erg toxisch zijn omdat het oxidatieve stress kan veroorzaken. Het is dus
een regulatie die nauwkeurig en snel moet kunnen gebeuren. Dit gebeurt via ferritine en transferrine:
- Transferrine: receptor voor Fe absorptie uit het dieet
- Ferritine: vormt een hol sferisch complex dat een overmaat Fe kan stockeren en zo toxiciteit kan voorkomen
Het is regulatie van translatie, zonder verandering in productie van mRNA’s. RNA bindende eiwitten kunnen direct
translatie initiatie stil leggen of mRNA stabiliteit beïnvloeden. Dit gebeurt veel sneller dan transcriptionele controle.
Regulatie gebeurt door Iron Respons Elementen (IRE’s): stukjes RNA in een haarspeld structuur (dmv H-bruggen) . IRE’s
worden gebonden door IRE binding protein (IRE-BP). → in 5’ UTR v/d H-keten van ferritine en in 3’ UTR van transferrine.
1. Als de ijzerniveaus hoog zijn
Normaal is IRE gebonden aan IRP (inactief). Als de ijzerconcentraties nu stijgen zal ijzer binden op IRE-BP, waardoor
het IRE-BP loskomt van de haarspeld. De translatie van ferritine kan nu doorgaan: Fe kan worden gestockeerd.
2. Als de ijzerniveaus laag zijn
Als er geen ijzer aanwezig is, zal het IRE-BP gebonden blijven op het IRE. De 5’ UTR zit nu voor het startcodon en de
translatie van ferritine kan niet doorgaan: Fe wordt niet gestockeerd.
MICRO RNA’S (MIRNA)
MiRNA’s zijn kleine RNA moleculen met een belangrijke regulatorische rol. Ze binden mRNA moleculen in de 3’ voor
regulatie van transcriptie, vaak van veel genen tegelijkertijd.
Meestal verhinderen ze translatie en verhogen ze de afbraak van mRNA moleculen. Een mismatch is meestal toegelaten.
Ze worden aangezien als een vorm van RNA interference (RNAi) omdat de processing via hetzelfde mechanisme gebeurt.
RNA INTERFERENCE
miRNA worden door RNA interference geprocessed: bescherming tegen dubbelstrengig RNA (bv van virussen).
1. Dicer (cytoplasmatisch endoribonuclease) gaat dubbelstrengig DNA verknippen.
MAAR als een virus in een cel zit en er zit dubbelstrengig DNA in, kan er ook enkelstrengig DNA zijn van virale
oorsprong, dit ook graag afbreken:
2. Korte stukjes dubbelstrengig DNA geactiveerd tot RISC complex (RNA induced silencing complex)
3. 1 van de 2 strengen wordt afgebroken: kort stukje RNA blijft over
4. Kan binden op een target RNA wanneer een complementariteit in sequentie is tussen de 2
Dit zelfde systeem wordt gebruikt door miRNA. Het miRNA komt tot expressie: door hetzelfde dicer enzyme stukjes uit
geknipt → dubbelstrengige moleculen: actieve miRNA’s → binden in 3’ UTR van een aantal genen → regulatie.
100% complementariteit is niet nodig: er kunnen mismatchen zijn.
1 mRNA heeft vaak meerdere miRNA bindingsplaatsen. In het PTEN tumor supressor gen zijn miRNA bindingsplaatsen
aanwezig in de 3’ UTR voor 7 versch miRNA’s. Voor sommige miRNA’s zijn er meerdere bindingsplaatsen.
HOOFDSTUK 6: PRINCIPES VAN GEN REGULATIE EN EPIGENETICA
GENETISCHE REGULATIE
CIS EN TRANS ACTING GENREGULATIE
Regulatie van genexpressie gebeurt aan de hand van cis en trans acting regulatie:
- Cis acting regulatie op DNA niveau
= een DNA sequentie die reguleert op zijn eigen DNA streng
o Regulatorische sequenties: promotors en enhancers / silencers
o Reguleert altijd 1 gen: 1 allel
- Trans acting regulatie
= een RNA of eiwit dat migreert door diffusie, reguleert op afstand. Bv. een transcriptiefactor
o Bindt op een regulatorisch element (korte DNA sequentie)
o Reguleert beide alleleln van een gen en kan meerdere genen tegelijk reguleren
Regulatie is uiteindelijk altijd een combinatie van cis en trans
- Enhancer (cis) en transcriptiefactor (trans) die erop bindt
- miRNA bindende sequentie (cis) en miRNA (trans) dat erop bindt
CIS ACTING ELEMENTEN IN RNA
Cis-acting RNA sequenties reguleren enkel het RNA transcript waarop het gelegen is. Ze liggen vaak in de niet-
getranslationeerde regio’s van het mRNA: 5’ en 3’ UTRs (untranslated regions). Deze worden dan gebonden door trans
activerende eiwitten en miRNA’s. Het is veel voorkomend, vooral de miRNA binding op de 3’ UTR.
In deze afbeelding wordt de expressie van gen A
gereguleerd door de trans-acting regulatoire
proteïne X en door microRNA Y, die beiden binden
aan de cis-acting elementen in de 5’ en 3’ UTR van
het mRNA.
GENETISCHE REGULATOREN VAN GENEXPRESSIE
PROMOTOR: DE AAN/UIT KNOP VAN GENEN
= cis-acting. De promotor is belangrijk bij de bepaling welke gensegmenten vd DNA streng transcriptie ondergaan.
RNA polymerase II: schrijft eiwit coderende genen af (long-non coding RNA’s en miRNA’s).
- vormt een groot transcriptie initiatie complex met algemene transcriptiefactoren
- vormt zich op (cis acting) consensus sequenties in de buurt van de transcriptie startplaats: de promotor
RNA polymerase I schrijft de meeste ribosomale RNA’s af en RNA polymerase III schrijft tRNA genen, één ribosomaal
RNA en sommige kleine RNA’s af.
Dit is een gemiddelde promotor met een aantal sequenties. Niet elke promotor bevat al deze sequenties: geen ervan is
nodig noch voldoende voor promotor activiteit. Er zijn zelfs promotors met geen van deze elementen. De RNA
polymerase II promotor bevat typisch:
, 1. BRE: TF-II-B recognition element: hierop kan transcriptiefactor II B binden.
2. TATA box
3. Inr: initiator element (A is de transcriptiestartplaats)
4. DPE: downstream core promotor element
ENHANCERS, SILENCERS, BOUNDARIES, INSULATORS
= cis-acting sequenties van typisch 4-9 bp. Bevinden zich zowel upstream als downstream van de promotor, vaak
binnen de 1,5 kb maar ook vaak veel verder.
- Enhancers versterken expressie
o Zitten meestal op kleinere afstand, maar soms ook veel bp verwijderd van het in te werken gen
o Bv. PAX6 gen wordt gereguleerd door een enhancer op grote afstand
- Silencers onderdrukken expressie
- Boundary sequenties:
o Insulators: blokkeren interactie tss enhancer en promotor door regulatorische elementen te binden
o Barrière elementen tussen euchromatine en heterochromatine
Er is een groot verschil tussen epigenetische en genetische boundary sequenties
TADS: TOPOLOGICALLY ASSOCIATING DOMAINS
Genoom bestaat uit blokjes van genen en enhancers die enkel
werken op genen in dat blokje. Tussen de blokjes zitten boundaries:
bepalen tot op welke genen enhancers kunnen inwerken.
- = genomische regio die promotor interacties limiteert, afgebakend door boundaries
- Evolutionair geconserveerd tussen species
- Verklaren hoe deleties en inversie nabijgelegen genen buiten de deletie of inversie kunnen beïnvloeden
TADs zijn lange stukken DNA met op het einde een hogere concentratie CTCF (CCTCT binding factor). Dit is een
insulator eiwit dat samen met cohesines de TAD zal afbakenen.
Bij syndactelie zijn de vingers samengegroeid bij de geboorte
door een inversie. Door deze inversie zullen een aantal
regulatorische elementen (enhancers en silencers) uit de groene,
in de oranje blok komen. Er gaan geen DNA verloren maar er
wordt een boundarie verplaatst waardoor sommige genen nu wel
of juist niet tot expressie komen. Dit kan ook bij bv. een deletie
van een boundary (bv. bij ADLD)
TRANSCRIPTIEFACTOREN
= DNA bindende eiwitten. Ze binden op cis-acting sequenties.
- Combinatorial: verschillende transcriptiefactoren binden tegelijkertijd
- Co-activatoren en co-repressoren
o Moduleren de actie van TF zonder dat ze DNA binden
o Werken via eiwit-eiwit interacties met regulatorische eiwitten
Transcriptiefactoren herkennen en binden DNA sequenties op specifieke plaatsen in het DNA om het effect op de
genregulatie uit te voeren. Er zijn 2 verschillende DNA bindende motieven:
,Zinc finger: 2 cys en 2 his. Hebben een 3D structuur die in de grote groeve van het DNA gaat ‘voelen’ als een
vinger, welke DNA sequentie het is. Het is een AZ sequentie die DNA sequenties kan aflezen. Er zijn versch
types om zo spec. sequenties te kunnen herkennen (in vitro maken voor specifieke sequenties).
Leucine zipper: een α-helix van 2 peptides die Leu hebben in elke draai van de helix. Zo komen
leucines op 2 rijtjes die in elkaar in grijpen tot α-helix. De peptides zijn langer en er zijn verdere
sequenties die ook in de groeve van de DNA molecule zal passen. Dit is als een wasknijper die op het DNA
zit, die ook de DNA sequentie kan herkennen.
SPLICING
Splice regions = geconserveerde sequenties op de overgangen tussen exonen en intronen.
1e keer geknipt op de splice donor: lassostructuur gemaakt doordat splice donor
sequentie wordt gebonden op de branch site. Er wordt een 2e keer geknipt op de
splice acceptor: intron verdwijnt en wordt afgebroken, exonen worden aan elkaar gezet.
Er zijn nog sequenties (cis-acting regulatorische RNA elementen) die splicing beïnvloeden.
Deze kunnen gelegen zijn in exonen of in intronen en kunnen enhancers zijn of suppressors.
− In exon gelegen → exonic splice enhancers ESE of exonic splice silencers ESS
− In intron gelegen → intronic splice enhancer ISS of intronic splice silencer ISE
Soms kunnen ze tegelijk inwerken op verschillende splice sites. Daarnaast kunnen ze zorgen voor alternatieve splicing
doordat het exon bv. een stukje korter wordt gemaakt of het intron een stukje korter.
Alternatieve splicing
= variatie in intron-exon junctions door:
- Gebruik van alternatieve splice donors (B) of acceptors (C)
- Exon skipping (D) - Alternatieve exonen (E)
De verschillende transcripten worden isovormen genoemd, vaak zijn er specifieke
transcripten per weefsel of voor bepaalde ontwikkelingsstadia. Ook zijn er vaak
verschillende isovormen voor de cellulaire compartimenten of voor secretie.
Er kunnen ook facultatieve exonen zijn: soms gebruikt en soms niet. Deze bevatten dan
vaak een eiwit domein dat in sommige weefsels wel gewenst is en in sommige weefsels niet.
Alternatieve splicing voor het CDKN2A gen
= een beetje een buitenbeentje in het genoom. Het is het enige gen in het genoom waar we overlappende genen
hebben: 2 genen bovenop elkaar maar in een ander leesraam. Het produceert op deze manier twee verschillende
tumor suppressor genen (P14 en P16 eiwit). De ene AZ zitten in een leesraam en de andere in een ander leesraam.
Komt veel voor bij virussen: genen coderen op een compacte manier in een kleiner genoom. Nadeel: 1 puntmutatie
zou kunnen zorgen voor uitval / mutatie van 2 genen
, REGULATIE VAN IJZER (FE) OPNAME TRANS-ACTING REGULATORISCH EIWIT
Fe is een belangrijk ion en cofactor, maar kan erg toxisch zijn omdat het oxidatieve stress kan veroorzaken. Het is dus
een regulatie die nauwkeurig en snel moet kunnen gebeuren. Dit gebeurt via ferritine en transferrine:
- Transferrine: receptor voor Fe absorptie uit het dieet
- Ferritine: vormt een hol sferisch complex dat een overmaat Fe kan stockeren en zo toxiciteit kan voorkomen
Het is regulatie van translatie, zonder verandering in productie van mRNA’s. RNA bindende eiwitten kunnen direct
translatie initiatie stil leggen of mRNA stabiliteit beïnvloeden. Dit gebeurt veel sneller dan transcriptionele controle.
Regulatie gebeurt door Iron Respons Elementen (IRE’s): stukjes RNA in een haarspeld structuur (dmv H-bruggen) . IRE’s
worden gebonden door IRE binding protein (IRE-BP). → in 5’ UTR v/d H-keten van ferritine en in 3’ UTR van transferrine.
1. Als de ijzerniveaus hoog zijn
Normaal is IRE gebonden aan IRP (inactief). Als de ijzerconcentraties nu stijgen zal ijzer binden op IRE-BP, waardoor
het IRE-BP loskomt van de haarspeld. De translatie van ferritine kan nu doorgaan: Fe kan worden gestockeerd.
2. Als de ijzerniveaus laag zijn
Als er geen ijzer aanwezig is, zal het IRE-BP gebonden blijven op het IRE. De 5’ UTR zit nu voor het startcodon en de
translatie van ferritine kan niet doorgaan: Fe wordt niet gestockeerd.
MICRO RNA’S (MIRNA)
MiRNA’s zijn kleine RNA moleculen met een belangrijke regulatorische rol. Ze binden mRNA moleculen in de 3’ voor
regulatie van transcriptie, vaak van veel genen tegelijkertijd.
Meestal verhinderen ze translatie en verhogen ze de afbraak van mRNA moleculen. Een mismatch is meestal toegelaten.
Ze worden aangezien als een vorm van RNA interference (RNAi) omdat de processing via hetzelfde mechanisme gebeurt.
RNA INTERFERENCE
miRNA worden door RNA interference geprocessed: bescherming tegen dubbelstrengig RNA (bv van virussen).
1. Dicer (cytoplasmatisch endoribonuclease) gaat dubbelstrengig DNA verknippen.
MAAR als een virus in een cel zit en er zit dubbelstrengig DNA in, kan er ook enkelstrengig DNA zijn van virale
oorsprong, dit ook graag afbreken:
2. Korte stukjes dubbelstrengig DNA geactiveerd tot RISC complex (RNA induced silencing complex)
3. 1 van de 2 strengen wordt afgebroken: kort stukje RNA blijft over
4. Kan binden op een target RNA wanneer een complementariteit in sequentie is tussen de 2
Dit zelfde systeem wordt gebruikt door miRNA. Het miRNA komt tot expressie: door hetzelfde dicer enzyme stukjes uit
geknipt → dubbelstrengige moleculen: actieve miRNA’s → binden in 3’ UTR van een aantal genen → regulatie.
100% complementariteit is niet nodig: er kunnen mismatchen zijn.
1 mRNA heeft vaak meerdere miRNA bindingsplaatsen. In het PTEN tumor supressor gen zijn miRNA bindingsplaatsen
aanwezig in de 3’ UTR voor 7 versch miRNA’s. Voor sommige miRNA’s zijn er meerdere bindingsplaatsen.
