MGOT Hoorcolleges Deeltoets 2
Hoorcollege 10 – gist genetica, screens
Gist als modelorganisme (Saccharomyces cerevisiae)
- Eencellige eukaryoten.
- Basale levensprocessen zijn vergelijkbaar (metabolisme/eiwittransport).
- Genetisch goed te bestuderen + eenvoudig.
o Makkelijk groeien, transformeerbaar met plasmiden, homologe recombinatie en
genotypes kunnen gecombineerd worden.
Homologe recombinatie: treedt spontaan op bij korte overeenkomende sequentie. Zo
kan er ook een knock-out gemaakt worden.
Gisten waar veel mee gewerkt wordt:
Budding yeast (Saccharomyces cerevisiae), bakkersgist
Fission yeast (Schizosaccharomyces pombe)
Gist tools: plasmiden met verschillende replicatie origins en selectie markers
Auxotrofe selectie markers: (URA3, LEU2, HIS3, ADE2, TRP1). Auxotroof moeten
in de plaat aanwezig zijn. Gereguleerde promotor (GAL).
Levenscyclus van gist
2 mating type van gisten (a/alfa), kunnen zelf
haploïd voorplanten. Als beide typen elkaar
tegen komen kunnen ze kruisen en diploïd
voortplanten. Diploïde cel kan sporen vormen
(4 haploïde sporen) onder ongunstige
omstandigheden.
Homothalic yeast: kan twee soorten haploïde
cellen maken. Geslacht wordt bepaald door het
MAT locus. Aan beide zijden ligt een kopie van
het gen (a en alfa). HO endonuclease induceert
een ds DNA breuk in MAT locus reparatie
met informatie van HMLa/HMRalfa locus.
Ontdekking van celcyclus genen in gist
Ontdekt door het zoeken naar temperatuurgevoelige mutaties. Bij een hoge temperatuur
functioneren de eiwitten niet meer: stoppen in specifieke stap van celcyclus.
Cyclin-dependent kinases
CDC28 (budding yeast) en cdc2 (fission yeast). Het menselijke CDK1 kan er in gist voor zorgen dat
celdeling normaal plaatsvindt (complementatie). De eiwitten zijn geconserveerd: essentieel.
Loss of function: stopt met delen. Gain of function: delen te snel (wee).
WEE1: wee1 deletie mutanten zijn klein en delen snel. Net als cdc28f (gain of function).
CDC25: cdc25 deletie mutanten stoppen in mitose. Net als cdc28-.
Epistase analyse
Door dubbel mutanten te maken kan de volgorde van genen
worden bepaald. De fenotypes moeten verschillend zijn. Het
dubbelmutant moet fenotype hebben van 1 van beide mutanten.
, Voorbeeld: verlies van wee1 mutant heeft te veel
deling, verlies van cdc28 mutant stopt celdeling.
Dubbelmutant heeft cdc28- fenotype
WEE1+ remt CDC28+ stimuleert celdeling.
Het fenotype wat je overhoudt zit downstream.
Complementatie
Complementatie: Het effect van de mutatie compenseren in een of meerdere genen.
Voorbeeld: kruisen van haploïde gisten, mutant type gen complementeren met wild type kopie van
het gen. Ander voorbeeld: complementatie met plasmide.
Practicum: Zoeken naar rode mutanten met genetische screen. Genetische screen: mutanten
maken waarin het proces is verstoord, hierna gen erbij zoeken.
Gist heeft een pathway om AMP te maken, of maakt van adenine in 1 stap AMP. Bij ADE2 en ADE1
mutant heeft de gist een rode kleur.
Yeast two-hybrid system
Y2H om eiwit-eiwit interacties te zien door een reporter gen af te schrijven. GAL4
transcriptiefactor werkt als een dimeer. Gal4p wordt aangezet als gist galactose
moet metaboliseren. Transcriptiefactor heeft twee domeinen (AD en DB) en
zonder elkaar functioneren die niet. De domeinen worden aan DNA bindend
domein en eiwit van interest verbonden als deze binden dan is er een actieve
transcriptie factor. Gal4p binding sites voor genen zetten en interacties testen.
Toepassingen:
Array based screening: individuele AD en DB gisten kruisen kijken
welke groeien.
Library screening: 1 DB gist kruisen met een bibliotheek van AD gisten.
Interactie domeinen vinden met Y2H
Welk deel van eiwit is nodig voor interactie?
Screenen met een librarie van fragmenten voor
interactie (minimal region of interaction).
Gist in practicum:
Geen gal4 (anders continue reporter aan), geen gal80 (anders fusie eiwit uitzetten).
DB:: MEK-2
AD:: LIN-42
Hoorcollege 10 – gist genetica, screens
Gist als modelorganisme (Saccharomyces cerevisiae)
- Eencellige eukaryoten.
- Basale levensprocessen zijn vergelijkbaar (metabolisme/eiwittransport).
- Genetisch goed te bestuderen + eenvoudig.
o Makkelijk groeien, transformeerbaar met plasmiden, homologe recombinatie en
genotypes kunnen gecombineerd worden.
Homologe recombinatie: treedt spontaan op bij korte overeenkomende sequentie. Zo
kan er ook een knock-out gemaakt worden.
Gisten waar veel mee gewerkt wordt:
Budding yeast (Saccharomyces cerevisiae), bakkersgist
Fission yeast (Schizosaccharomyces pombe)
Gist tools: plasmiden met verschillende replicatie origins en selectie markers
Auxotrofe selectie markers: (URA3, LEU2, HIS3, ADE2, TRP1). Auxotroof moeten
in de plaat aanwezig zijn. Gereguleerde promotor (GAL).
Levenscyclus van gist
2 mating type van gisten (a/alfa), kunnen zelf
haploïd voorplanten. Als beide typen elkaar
tegen komen kunnen ze kruisen en diploïd
voortplanten. Diploïde cel kan sporen vormen
(4 haploïde sporen) onder ongunstige
omstandigheden.
Homothalic yeast: kan twee soorten haploïde
cellen maken. Geslacht wordt bepaald door het
MAT locus. Aan beide zijden ligt een kopie van
het gen (a en alfa). HO endonuclease induceert
een ds DNA breuk in MAT locus reparatie
met informatie van HMLa/HMRalfa locus.
Ontdekking van celcyclus genen in gist
Ontdekt door het zoeken naar temperatuurgevoelige mutaties. Bij een hoge temperatuur
functioneren de eiwitten niet meer: stoppen in specifieke stap van celcyclus.
Cyclin-dependent kinases
CDC28 (budding yeast) en cdc2 (fission yeast). Het menselijke CDK1 kan er in gist voor zorgen dat
celdeling normaal plaatsvindt (complementatie). De eiwitten zijn geconserveerd: essentieel.
Loss of function: stopt met delen. Gain of function: delen te snel (wee).
WEE1: wee1 deletie mutanten zijn klein en delen snel. Net als cdc28f (gain of function).
CDC25: cdc25 deletie mutanten stoppen in mitose. Net als cdc28-.
Epistase analyse
Door dubbel mutanten te maken kan de volgorde van genen
worden bepaald. De fenotypes moeten verschillend zijn. Het
dubbelmutant moet fenotype hebben van 1 van beide mutanten.
, Voorbeeld: verlies van wee1 mutant heeft te veel
deling, verlies van cdc28 mutant stopt celdeling.
Dubbelmutant heeft cdc28- fenotype
WEE1+ remt CDC28+ stimuleert celdeling.
Het fenotype wat je overhoudt zit downstream.
Complementatie
Complementatie: Het effect van de mutatie compenseren in een of meerdere genen.
Voorbeeld: kruisen van haploïde gisten, mutant type gen complementeren met wild type kopie van
het gen. Ander voorbeeld: complementatie met plasmide.
Practicum: Zoeken naar rode mutanten met genetische screen. Genetische screen: mutanten
maken waarin het proces is verstoord, hierna gen erbij zoeken.
Gist heeft een pathway om AMP te maken, of maakt van adenine in 1 stap AMP. Bij ADE2 en ADE1
mutant heeft de gist een rode kleur.
Yeast two-hybrid system
Y2H om eiwit-eiwit interacties te zien door een reporter gen af te schrijven. GAL4
transcriptiefactor werkt als een dimeer. Gal4p wordt aangezet als gist galactose
moet metaboliseren. Transcriptiefactor heeft twee domeinen (AD en DB) en
zonder elkaar functioneren die niet. De domeinen worden aan DNA bindend
domein en eiwit van interest verbonden als deze binden dan is er een actieve
transcriptie factor. Gal4p binding sites voor genen zetten en interacties testen.
Toepassingen:
Array based screening: individuele AD en DB gisten kruisen kijken
welke groeien.
Library screening: 1 DB gist kruisen met een bibliotheek van AD gisten.
Interactie domeinen vinden met Y2H
Welk deel van eiwit is nodig voor interactie?
Screenen met een librarie van fragmenten voor
interactie (minimal region of interaction).
Gist in practicum:
Geen gal4 (anders continue reporter aan), geen gal80 (anders fusie eiwit uitzetten).
DB:: MEK-2
AD:: LIN-42
