Werkcollege 13: Het zuiveren van eiwitten
Eiwitzuivering is het proces om van een mengsel van eiwitten naar één enkel zuiver eiwit te
komen. Voor het onderzoek naar eiwitten is het verkrijgen van zuiver eiwit noodzakelijk.
Grof gesteld bestaat de eiwitzuivering meestal uit drie fases: Het eiwit vrijmaken uit cellen,
de eiwitten scheiden van de niet-eiwitten, om vervolgens het gewenste eiwit te scheiden van
alle andere eiwitten.
Leeruitkomsten
De student kan…
… uitleggen wat geltechnieken als SDS-PAGE, IEF en 2D gels zijn, uitleggen hoe deze
werken en de resultaten analyseren.
… verschillende methoden van het vrijmaken van eiwitten uit cellen en weefsels
benoemen en uitleggen.
… verschillende methoden van selectieve precipitatie benoemen en uitleggen.
… verschillende methoden om eiwitten te ontzouten benoemen en uitleggen.
… uitleggen hoe gelfiltratie werkt.
… uitleggen hoe ionwisselingschromatografie werkt.
… uitleggen hoe hydrofobe interactie chromatografie werkt.
… uitleggen hoe affiniteit chromatografie werkt.
... de zuiverheid van een eiwit bepalen.
… de zuiverheid en opbrengst van een gezuiverd enzym berekenen.
… hoe de zuivering van gekloneerde eiwitten m.b.v. tags werkt.
… chromatografie resultaten lezen en uitleggen
… uitleggen hoe een HPLC werkt.
Voorbereiding op WC13:
Bekijk het interactieve hoorcolleges over het zuiveren van eiwitten, het bepalen
en/of berekenen van de opbrengst en zuiverheid en verschillende Tags die voor
kloneren gebruikt worden.
HC11: https://hsleiden.mediamission.nl/Mediasite/Play/3cbddaf0e2a84ed6b76167ff92c8a4201d
HC12: https://hsleiden.mediamission.nl/Mediasite/Play/883f2b72146c4e2f9dd66c1e0262aa1c1d
HC13: https://hsleiden.mediamission.nl/Mediasite/Play/2b72ee5ec32848a0baa565a813b36b651d
Bekijk de volgende clips als je meer wil weten over het specifieke onderwerp
o SDS/PAGE https://www.youtube.com/watch?v=toPpdoBYPWo
o Iso-electrisch punt https://www.youtube.com/watch?v=ebrAlKLvw0M
o 2D-gels https://www.youtube.com/watch?v=uwVgfDOpdPI
o HPLC/Äkta https://www.youtube.com/watch?
v=IUwRWn9pEdg&list=PLetrcQ_JUQSmK4yEiMDyMoiaaZYEeQPDy
o HPLC - How to read Chromatogram Easy Explained - Simple Animation HD
https://www.youtube.com/watch?v=qXmSb6Xwr5k
o Cel fractionering https://www.youtube.com/watch?v=SjaFUJhzY9Q
, o Ionwisselingschromatografie https://www.youtube.com/watch?
v=pBN4sWbwf9s
https://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8
o Gelfiltratie https://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ
o HIC https://www.youtube.com/watch?v=v6SPK6ZovgA
o Affiniteit chromatografie https://www.youtube.com/watch?v=FUAQKjKT99Y
o Strategie van eiwit isolaties https://www.youtube.com/watch?v=KAkZGpdmWio
o HIS-tags https://www.youtube.com/watch?v=DfzB6BtSjBY&t=123s
https://www.youtube.com/watch?v=czemQluYXns
Maak de voorbereidingsvragen in dit bestand.
Maak met een groep van ca. 4 studenten alle 4 eindopdrachten uit dit bestand en
bereid een presentatie van de antwoorden voor die in de les gegeven kan worden
aan je medestudenten.
Maak de onderstaande vragen ter voorbereiding op het werkcollege.
1. Je hebt ontdekt dat er in een gist lysaat enzymatisch activiteit werd vastgesteld in een
recombinant Histon H3 complex. Je wilt uiteindelijk de identiteit van het eiwit welke
deze activiteit veroorzaakt vaststellen. Maar in eerst instantie wil je de grootte van
het enzym complex kunnen vaststellen. Welke analyse methode stel je voor? (alleen
de naam noemen). SDS Page
2. Je wilt nu je het molecuulgewicht kent ook het iso electrisch punt bepalen. Welke
analyse methode stel je voor? (alleen de naam noemen). 2D SDS-PAGE
3. Waarom doe je bij 2D-gels altijd eerste de IEF stap en daarna de SDS-PAGE en nooit
andersom? Bij een SDS Page denatureer je je eiwitten waardoor ze daarna niet
meer in hun tertiaire structuur zijn en ze niet meer functioneel zijn.
4. Beschrijf minstens 3 manieren om bacteriën te lyseren.
Enzymatische lysis, sonificeren, cellen opblazen dmv osmose, met detergents/zeep
5. Deze vraag gaat over de isolatie van cel organellen. Lees het voorschrift:
https://fankhauserblog.wordpress.com/1992/11/18/isolation-of-chloroplasts-by-
differential-centrifugation/
Wat is de functie van het mortier en stamper in dit experiment? Weefsels/cellen
homogeniseren
Wat is de functie van het kaasdoek in dit experiment? Filtreren van de te grote
stukken weefsel
Wat is de functie van de eerste langzame centrifugatiestap (S1)? Beschrijf de inhoud
van de pellet en het supernatant. Bij de eerste centrifuge stap laat je de plant delen
neerslaan en werk je door met het supernatant en daarna kan je weer centrifugeren
om een scheiding te maken op wat je wilt behouden. als je te hard gaat centrifugeren
dan slaan bv ook je organellen neer die je wel wilt behouden
Eiwitzuivering is het proces om van een mengsel van eiwitten naar één enkel zuiver eiwit te
komen. Voor het onderzoek naar eiwitten is het verkrijgen van zuiver eiwit noodzakelijk.
Grof gesteld bestaat de eiwitzuivering meestal uit drie fases: Het eiwit vrijmaken uit cellen,
de eiwitten scheiden van de niet-eiwitten, om vervolgens het gewenste eiwit te scheiden van
alle andere eiwitten.
Leeruitkomsten
De student kan…
… uitleggen wat geltechnieken als SDS-PAGE, IEF en 2D gels zijn, uitleggen hoe deze
werken en de resultaten analyseren.
… verschillende methoden van het vrijmaken van eiwitten uit cellen en weefsels
benoemen en uitleggen.
… verschillende methoden van selectieve precipitatie benoemen en uitleggen.
… verschillende methoden om eiwitten te ontzouten benoemen en uitleggen.
… uitleggen hoe gelfiltratie werkt.
… uitleggen hoe ionwisselingschromatografie werkt.
… uitleggen hoe hydrofobe interactie chromatografie werkt.
… uitleggen hoe affiniteit chromatografie werkt.
... de zuiverheid van een eiwit bepalen.
… de zuiverheid en opbrengst van een gezuiverd enzym berekenen.
… hoe de zuivering van gekloneerde eiwitten m.b.v. tags werkt.
… chromatografie resultaten lezen en uitleggen
… uitleggen hoe een HPLC werkt.
Voorbereiding op WC13:
Bekijk het interactieve hoorcolleges over het zuiveren van eiwitten, het bepalen
en/of berekenen van de opbrengst en zuiverheid en verschillende Tags die voor
kloneren gebruikt worden.
HC11: https://hsleiden.mediamission.nl/Mediasite/Play/3cbddaf0e2a84ed6b76167ff92c8a4201d
HC12: https://hsleiden.mediamission.nl/Mediasite/Play/883f2b72146c4e2f9dd66c1e0262aa1c1d
HC13: https://hsleiden.mediamission.nl/Mediasite/Play/2b72ee5ec32848a0baa565a813b36b651d
Bekijk de volgende clips als je meer wil weten over het specifieke onderwerp
o SDS/PAGE https://www.youtube.com/watch?v=toPpdoBYPWo
o Iso-electrisch punt https://www.youtube.com/watch?v=ebrAlKLvw0M
o 2D-gels https://www.youtube.com/watch?v=uwVgfDOpdPI
o HPLC/Äkta https://www.youtube.com/watch?
v=IUwRWn9pEdg&list=PLetrcQ_JUQSmK4yEiMDyMoiaaZYEeQPDy
o HPLC - How to read Chromatogram Easy Explained - Simple Animation HD
https://www.youtube.com/watch?v=qXmSb6Xwr5k
o Cel fractionering https://www.youtube.com/watch?v=SjaFUJhzY9Q
, o Ionwisselingschromatografie https://www.youtube.com/watch?
v=pBN4sWbwf9s
https://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8
o Gelfiltratie https://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ
o HIC https://www.youtube.com/watch?v=v6SPK6ZovgA
o Affiniteit chromatografie https://www.youtube.com/watch?v=FUAQKjKT99Y
o Strategie van eiwit isolaties https://www.youtube.com/watch?v=KAkZGpdmWio
o HIS-tags https://www.youtube.com/watch?v=DfzB6BtSjBY&t=123s
https://www.youtube.com/watch?v=czemQluYXns
Maak de voorbereidingsvragen in dit bestand.
Maak met een groep van ca. 4 studenten alle 4 eindopdrachten uit dit bestand en
bereid een presentatie van de antwoorden voor die in de les gegeven kan worden
aan je medestudenten.
Maak de onderstaande vragen ter voorbereiding op het werkcollege.
1. Je hebt ontdekt dat er in een gist lysaat enzymatisch activiteit werd vastgesteld in een
recombinant Histon H3 complex. Je wilt uiteindelijk de identiteit van het eiwit welke
deze activiteit veroorzaakt vaststellen. Maar in eerst instantie wil je de grootte van
het enzym complex kunnen vaststellen. Welke analyse methode stel je voor? (alleen
de naam noemen). SDS Page
2. Je wilt nu je het molecuulgewicht kent ook het iso electrisch punt bepalen. Welke
analyse methode stel je voor? (alleen de naam noemen). 2D SDS-PAGE
3. Waarom doe je bij 2D-gels altijd eerste de IEF stap en daarna de SDS-PAGE en nooit
andersom? Bij een SDS Page denatureer je je eiwitten waardoor ze daarna niet
meer in hun tertiaire structuur zijn en ze niet meer functioneel zijn.
4. Beschrijf minstens 3 manieren om bacteriën te lyseren.
Enzymatische lysis, sonificeren, cellen opblazen dmv osmose, met detergents/zeep
5. Deze vraag gaat over de isolatie van cel organellen. Lees het voorschrift:
https://fankhauserblog.wordpress.com/1992/11/18/isolation-of-chloroplasts-by-
differential-centrifugation/
Wat is de functie van het mortier en stamper in dit experiment? Weefsels/cellen
homogeniseren
Wat is de functie van het kaasdoek in dit experiment? Filtreren van de te grote
stukken weefsel
Wat is de functie van de eerste langzame centrifugatiestap (S1)? Beschrijf de inhoud
van de pellet en het supernatant. Bij de eerste centrifuge stap laat je de plant delen
neerslaan en werk je door met het supernatant en daarna kan je weer centrifugeren
om een scheiding te maken op wat je wilt behouden. als je te hard gaat centrifugeren
dan slaan bv ook je organellen neer die je wel wilt behouden
