Samenvatting uitgewerkte doelstellingen zelfstudies menselijke genetica

ZELFSTUDIE: TECHNIEKEN VOOR DETECTIE VAN GENETISCHE VARIANTEN

SANGER SEQUENCING


BESCHRIJF DE TECHNIEK/PROCEDURES MET ALLE TECHNISCHE DETAILS
- Methode voor DNA sequencing
- Elektroforese betrokken & gebaseerd op willekeurige opname van ketenbeëindigende
dideoxynucleotiden door DNA-polymerase tijdens in vitro DNA-replicatie
- Makkelijk uitvoerbaar
- Speciale PCR gevolgd door gelelktroforese
o Speciale PCR: toevoeging DNA, DNA-polymerase, DNA-nucleotiden, primers &
dideoxynucleotiden
o Dideoxynucleotide = lijkt normaal nucleottide maar geen OH-groep op 3’-uiteinde
=> DNA replicatie stopt
o Aan elke dideoxynucleotide kleurstof gebonden => fluoresceert
- Na replicatie ontstaan gelabelde DNA-fragmenten verschillend in lengte
- Dmv gelelktroforese fragmenten scheiden op lengte
o Gel = netwerk van vezels die moleculaire zeef vormen
o DNA negatief geladen dus bewegen in gel naar positieve pool zodra spanning op gel wordt
gezet => hoe kleiner fragment, hoe sneller ze bewegen ing el
- Op niveau van genoom & transcriptoom
- Gouden standaard


MAAK EEN SCHAMATISCHE TEKENING MET WEERGAVE VAN DE BELANGRIJKSTE
TECHNISCHE DETAILS




TOEPASSINGEN
- Nauwkeurige analyse 1 of enkele genen
- Valideren resultaten grootschalige sequencing (bv NGS)
- Opsporen specifieke mutaties voor genetische screening
- Genetische variaties onderzoeken die invloed hebben op medicijnreacties
 Standaard methode voor detecteren van vaianten van 1nucleotide & kleine inserties/deleties


VOOR- & NADELEN
Nadelen

- Beperkt aantal genen
- Beperkt aantal patiënten



1

,Voordelen

- Sensitiviteit = 100% & hoge nauwkeurigheid
- Kosteneffectief voor kleinschalige projecten
- Lange leeslengtes


WAAROM WEL/NIET GESCHIKT VOOR BEPAALDE PROCEDURE
Wel geschikt

- Kleine DNA-fragmenten (tot 1.000bp)
- Bekende & gerichte regios
- Variantverificatie of kwaliteitscontrole
- Kleine aantallen monsters

MASSIVE PARALLELE DNA SEQUENCING: WHOLE EXOME SEQUENCING


BESCHRIJF DE TECHNIEK/PROCEDURES MET ALLE TECHNISCHE DETAILS
- Sequencen van alle eiwitcoderende regio’s van genen in een genoom
o = exonen = 1,2% van genoom
o Meeste bekende ziekteveroorzakende mutaties hier aanwezig
- 2stappen
o Selecteren deel DNA dat eiwitten codeert = exonen
o Sequencen exon-DNA mbv high-throughput DNA-sequencingtechnologie

Stap 1

- Microarrays = enkelstrengige oligonucleotiden met sequentie uit mensleijk genoom
=> gebied van belang aan oppervlak bedekken
- Genomisch DNA geknipt om dubbelstrengs fragmenten te vormen
o Fragementen ondergaan eindherstel
o Adapters met universele primingsequenties toegevoegd
o Fragmenten worden gehybridiseerd met oligo’s op microarray
niet-gehydridiseerde worden weggewassen => gewenste worden geëlueerd
o Fragmenten daarna geamplificieerd mbv PCR

Stap 2

- Short-read-NGS-systemen zijn geschikt voor analyseren van relatief korte stukken DNA-sequentie
=> zoals in menselijk genoom voorkomen




2

,MAAK EEN SCHAMATISCHE TEKENING MET WEERGAVE VAN DE BELANGRIJKSTE
TECHNISCHE DETAILS




TOEPASSINGEN
- Sequencing op genoom niveau => exonen
- SNV’s, indels & kleine CNVs => kleine genetische varianten
- DNA-test gebruikt om eiwitcoderende delen van genen te analyseren & oorzaak genetische
aandoeningen achterhalen
- Diagnose van onbekende of heterogene syndromen
identificeren oorzaken specifieke ziektes
& opsporen erfelijke varianten in onbekende gevallen
 Zowel in academisch onderzoek als bij klinische diagnostiek
 Vooral bij patiënten met onduidelijk ziektebeeld, ziektebeeld met groot aantal ziekte veroorzakende
genen & ziektebeeld waarvoor nog geen ziekte veroorzakende genen gekend zijn


VOOR- & NADELEN
Voordelen

- Groot aantal gekende ziekteveroorzakende genen
- Minder data te analysern => eenvoudigere interpretatie
- Ideaal voor diagnostiek van erfelijke ziekten

Nadelen

- Onduidelijk fenotype
- Mist varianten in niet-coderende regio’s
- Beperkte sensitiviteit
- Kan RNA-splicing of regulatieproblemen missen
- Grote kost door dure kis & vele werkuren




3

, WAAROM WEL/NIET GESCHIKT VOOR BEPAALDE PROCEDURE
- Effectief bij onderzoek naar zeldzame mendeliaanse ziekten
=> efficiënte manier om genetische varianten in alle genen v/e individu te identificeren
- Vaak aanvulling op andere test
o Mutaties vinden in genen waarvan al bekend is dat ze ziekten veroorzaken
o Nieuwe genen identificeren door exomen van patiënten met vergelijkbare kenmerken te
vergelijken

MASSIVA PARALLELE DNA SEQUENCING: WHOLE GENOME SEQUENCING


BESCHRIJF DE TECHNIEK/PROCEDURES MET ALLE TECHNISCHE DETAILS
Massieve parallele DNA-sequencing = next generation sequencing

- Alle DNA fragmenten in sample kunnen tegelijkertijd gesequenced worden
=> geen gelelektroforese nodig
=> betere output
- Volledige chromosomale DNA v/e organisme gesequenced
=> ook DNA mitochondriën & chloroplasten
- 2 verschillende soorten
o Start DNA sequentie eerst geamplificeerd met PCR
o Singel molecule sequencing
- Sequencing reactie gemonitord terwijl elke nucleotide wordt toegevoegd bij DNA synthese
o = sequencing-by-synthesis
- Leest volledige DNA van organisme
o Intronen, exonen, promotors & repetitieve gebieden


MAAK EEN SCHAMATISCHE TEKENING MET WEERGAVE VAN DE BELANGRIJKSTE
TECHNISCHE DETAILS




4