Chromatografische technieken voor eiwitzuivering + Hoe gebonden
eiwitten loskomen + Nadeel gelfiltratiechromatografie
Zuiveren van eiwitten noodzakelijk 1ste stap om exacte functie en AZ-sequentie
van proteïne te bepalen.
Scheiding aan de hand van:
- oplosbaarheid
- grootte
- vorm
- lading
- bindingsaffiniteit
- pH
- moleculair gewicht
- densiteit
Assay: Het uitvoeren van een test of experiment om een specifieke
eigenschap, activiteit of concentratie van een stof (bijvoorbeeld een eiwit,
enzym, of een molecuul) te meten of te detecteren.
Protein purification is to maximize the specific activity.
Niet zuiver Zuiver
The specific activity will rise as the purification proceeds and the protein mixture
being assayed consists to a greater extend of your target protein: pure protein
has a constant and high specific activity.
We scheiden de contaminaties stelselmatig van het goede eiwit. Dit essay kan
op basis van onder andere geur, kleuren lading uitgevoerd worden. Het is wel
moeilijk om te gissen welke tube we dan precies verdere zuivering laten
ondergaan, want een eiwit kan eerst in tube 1 zitten en dan in tube 8.
, Differentiële centrifugatie: Proteïne vrij krijgen uit de cel alvorens de
purificatie
Principe: Densere materialen zullen een pellet vormen bij een lagere
centrifugale kracht.
Om bv. celkernen van bacteriën of van een medium te scheiden (denk aan
een fruitcentrifuge). Een rotor draait heel snel en alle deeltjes erin ondergaan
een centrifugale kracht. De bacteriën liggen dan uiteindelijk of de bodem.
Deze methode kan ook gebruikt worden om mitochondriën en andere
celorganellen van elkaar te scheiden. Hier voor zal de centrifuge langer en
sneller draaien. Hoe kleiner en fijner je wil filteren, hoe vaker je moet filteren.
1. Salting out (oplosbaarheid)
Scheiden op basis van oplosbaarheid in water en die hangt af van de
hoeveelheid zout. Proteïne minder oplosbaar bij hogere zoutconcentratie. Het
is veilig geprecipiteerd omdat het eiwit tijdens het precipitatieproces op een
manier is neergeslagen zonder dat de eiwitstructuur of -functie verloren gaat.
Na precipitatie eindig je vaak met minder eiwit in de oplossing, omdat een
deel van het eiwit uit de oplossing neerslaat en wordt gescheiden. Het is een
goede methode voor samples afkomstig van een buitenomgeving (want veel)
en het is goedkoop. Er is een hoge specifieke activiteit op het einde. Zout
wordt verwijderd door dialyse.
eiwitten loskomen + Nadeel gelfiltratiechromatografie
Zuiveren van eiwitten noodzakelijk 1ste stap om exacte functie en AZ-sequentie
van proteïne te bepalen.
Scheiding aan de hand van:
- oplosbaarheid
- grootte
- vorm
- lading
- bindingsaffiniteit
- pH
- moleculair gewicht
- densiteit
Assay: Het uitvoeren van een test of experiment om een specifieke
eigenschap, activiteit of concentratie van een stof (bijvoorbeeld een eiwit,
enzym, of een molecuul) te meten of te detecteren.
Protein purification is to maximize the specific activity.
Niet zuiver Zuiver
The specific activity will rise as the purification proceeds and the protein mixture
being assayed consists to a greater extend of your target protein: pure protein
has a constant and high specific activity.
We scheiden de contaminaties stelselmatig van het goede eiwit. Dit essay kan
op basis van onder andere geur, kleuren lading uitgevoerd worden. Het is wel
moeilijk om te gissen welke tube we dan precies verdere zuivering laten
ondergaan, want een eiwit kan eerst in tube 1 zitten en dan in tube 8.
, Differentiële centrifugatie: Proteïne vrij krijgen uit de cel alvorens de
purificatie
Principe: Densere materialen zullen een pellet vormen bij een lagere
centrifugale kracht.
Om bv. celkernen van bacteriën of van een medium te scheiden (denk aan
een fruitcentrifuge). Een rotor draait heel snel en alle deeltjes erin ondergaan
een centrifugale kracht. De bacteriën liggen dan uiteindelijk of de bodem.
Deze methode kan ook gebruikt worden om mitochondriën en andere
celorganellen van elkaar te scheiden. Hier voor zal de centrifuge langer en
sneller draaien. Hoe kleiner en fijner je wil filteren, hoe vaker je moet filteren.
1. Salting out (oplosbaarheid)
Scheiden op basis van oplosbaarheid in water en die hangt af van de
hoeveelheid zout. Proteïne minder oplosbaar bij hogere zoutconcentratie. Het
is veilig geprecipiteerd omdat het eiwit tijdens het precipitatieproces op een
manier is neergeslagen zonder dat de eiwitstructuur of -functie verloren gaat.
Na precipitatie eindig je vaak met minder eiwit in de oplossing, omdat een
deel van het eiwit uit de oplossing neerslaat en wordt gescheiden. Het is een
goede methode voor samples afkomstig van een buitenomgeving (want veel)
en het is goedkoop. Er is een hoge specifieke activiteit op het einde. Zout
wordt verwijderd door dialyse.
