Biochemische Laboratoriumtechnieken

1 Chromatografie
1.1 Inleiding
LPC/FPLC= Grote biomoleculen zuiveren → DNA en eiwitten.

1.2 Begrippen en formules
1.2.1 Begrippen
Stationaire fase Kolompakking
Mobiele fase Solvent, eluens
Elutie Verwijderen product van kolom door oplossen in eluens
Eluaat Eluens dat uit kolom komt
Dode tijd Tijd die solvent nodig heeft om door de kolom te migreren
Retentietijd (tR) Tijd tussen opbrengen staal en piekmaximum
Netto retentietijd Tijd tussen solventpiek en piekmaximum
Schotelgetal (N) Maat voor de efficiëntie van de kolom voor één component
Resolutiefactor Scheidingscapaciteit van de kolom
1.2.2 Formules
𝑡𝑟
Schotelgetal 𝑁 = 16. [ ]2 Smalle of brede pieken
𝑤
𝐿
HETP 𝐻=𝑁 Hoogte equivalent met theoretische plaat
𝐿
𝑢= (mobiele fase)
𝑇𝑚
Lineaire snelheid
𝐿
𝑣 = 𝑇𝑟 (product)
′ ′
′ ′ R = 1: 𝑤1 + 𝑤2 = 2(𝑡𝑅2 − 𝑡𝑅1 )
𝑡𝑅2 − 𝑡𝑅1
Resolutiefactor 𝑅 = 2. R < 1: overlap tussen pieken
𝑤1 + 𝑤2 R > 1: goede scheiding

𝑣 𝑡𝑚
Retentiefactor 𝑅𝑓 = =
𝑢 𝑡𝑟

′ = selectiviteitsfactor = efficiëntie van
𝑡𝑅2
Relatieve retentie 𝛼= ′ fasensysteem → afstand tussen pieken.
𝑡𝑅1
Hoe groter  , hoe verder pieken van elkaar zijn

𝐶𝑠
Verdelingscoëfficiënt 𝐾 =
𝐶𝑚

𝐶𝑠 . 𝑉𝑠 𝑉𝑠
Capaciteitsfactor 𝑘′ = = 𝐾.
𝐶𝑚 . 𝑉𝑚 𝑉𝑚



1.3 Oplossend vermogen van een kolom
- Schotelgetal (efficiëntie van de kolom)
- Relatieve retentie (efficiënt van die fasensysteem)



AD Biochemische Laboratoriumtechnieken – Deel 3: Chromatografie 1

,  klein → kleine afstand tussen
twee pieken

 groot → grote afstand tussen
twee pieken

N klein → brede pieken

N groot → smalle pieken

Beste?  groot en N groot. Smalle
pieken die ver van elkaar liggen.



1.3.1 Invloed van de kolom
Van Deemtervergelijking:
𝐵
𝐻 = 𝐴 + + 𝐶. 𝑢 → T = cte
𝑢
𝐶′
𝐻 = 𝐴 + 𝐵′ . 𝑇 + → µ = cte
𝑇

Eddy-diffusie (A):

Wanneer gelijke moleculen niet allemaal dezelfde weg afleggen → niet allemaal dezelfde snelheid →
zoneverbreding.
Goede kolom= relatief kleine beads met gelijke grootte.

Longitudinale diffusie (B) :

Diffusie van de component in de mobiele fase → zoneverbreding.
Minder diffusie bij hogere elutiesnelheid.

Weerstand tegen stofoverdracht (C):

Grote elutiesnelheid zorgt voor een onvolledig evenwicht → zoneverbreding.


A: onafh van u → horizontale rechte

B: afh van u → dalende rechte (lineaire snelheid)

C: afh van u → stijgende rechte

Zwarte volle lijn: netto van drie parameters → mag
geen te grote longitudinale diffusie en geen
onvolledige uitwisseling.




AD Biochemische Laboratoriumtechnieken – Deel 3: Chromatografie 2

, 1.3.2 Invloed fasensysteem
1.3.2.1 Capaciteitsfacto, k’
= maat voor de vertraging van de component door de stationaire fase.
- Hoe groter k’, hoe groter scheidingstijd
- Ideale k’-waarden liggen tussen 1 en 5

1.3.2.2 Relatieve retentie of scheidingsfactor
= maat voor de selectiviteit van het fasensysteem.
𝑡 ′ 𝑅2
- 𝛼 = 𝑡 ′ 𝑅1, waarbij t’R2 > t’R1
𝑘′2
- 𝛼 = 𝑘′1

1.3.3 Invloed van k’,  en N op de resolutie R
𝛼−1 𝑘′2 1 𝐿
𝑅= . ′ . √
𝛼 𝑘 2+1 4 𝐻

- Indien R < 1 → R verhogen door N, k’ of  te verhogen
- Hoge  → goede resolutie
- R maal 2 → lengte kolom maal 4
- N zit in H

Voorbeeld:




afname k’ → afname resolutie
toename k’ → toename resolutie


afname N → bolle pieken
toename N → scherpe pieken


afname  → korte afstand tss pieken
toename  → lange afstand tss pieken




1.4 Indeling chromatografie
Zuivering van biomoleculen → gebruik van verschillende
chromatografietechnieken.
Elke stap op 4 punten optimaliseren:
Resolutie, opbrengst, snelheid en capaciteit.
→ Deze 4 punten zijn onderling met elkaar verbonden.




AD Biochemische Laboratoriumtechnieken – Deel 3: Chromatografie 3