Alle 20 AZ:
Zuiveringsmethodes voor proteïnen:
1: Sal'ng out: Door toevoeging van een zout zal de zoutconcentra'e s'jgen en worden proteïne
minder oplosbaar, de zoutconcentra'e waarbij een proteïnen uit de oplossing valt hangt af van welk
proteïnen, dus kan het gebruikt worden al een scheidingsmethoden. Het is een rela'ef simpele
methoden en kan best gebruikt worden als ini'ële stap voordat men meer geavanceerde technieken
gaat gebruiken, het zout kan nadien eruit gefilterd worden door dialyse
2: Dialyse: Door een oplossing in een zak te steken met en semipermeabele wand kan dialyse
kleinere moleculen (zoals zouten en ionen) scheiden van grotere moleculen (zoals proteïnen).
Dit komt omdat de dialyse zak wordt geplaatst in een bufferoplossing waarin zich geen kleine
moleculen bevinden. De moleculen die kleiner zijn dan de poriën in de dialyse zak gaan dan naar het
buffermengsel migreren terwijl de grotere moleculen in de zak gaan ziIen, na verloop van 'jd
bevinden er zich enkel nog de grotere moleculen in de zak en kan deze uit de buffer worden gehaald.
3: gel-filtra'e chromatography: een preciezere methoden van scheiding van moleculen o.b.v. hun
grooIe; door een sample vanboven op een kolom, die gevuld is met een gel (bv agarose), te plaatsen
gaan de moleculen gescheiden kunnen worden. Dit omdat het gel gevuld is met poreuze beads,
kleinre moleculen gaan zich dan in of doorheen deze beads bevinden wat hun migra'e naar de
,bodem vertraagd, terwijl grotere moleculen niet in de beads geraken en dus sneller migreren naar de
bodem, zo krijgt men een scheiding v/d moleculen o.b.v. hun grooIe.
4: Ion-exchange chromatography: als men een hoge zuiverheid wenst is aangeraden om meerdere
chromatografien toe te passen, Waarbij de gel chrom de molecule ging sorteren op grooIe gaat de
ion-exch chrom de moleculen sorteren o.b.v. zijn neIo lading bij een bepaalde pH waarde.
Dit is op te delen in 2 mogelijkheden: Ca'on- en Anion-exchange chromatography. Bij de ca'on-
exchange zijn er beads met een nega'eve lading in het gel waardoor alle posi'ef geladen deeltjes
gaan binden en alle nega'eve deeltjes direct naar de bodem zakken, de nega'eve deeltjes kunnen er
dan uitgefilterd worden. Nadien gaan de deeltjes met de kleinste neIo posi'eve lading als eerst naar
beneden zakken, met de grootste neIo posi'eve ladingen als laatste naar beneden, zo krijgt men
een verdeling o.b.v. de grooIe v/d neIo posi'eve lading. Analoog voor de Anion-exch.
5: affiniteit chromatography: deze techniek maakt gebruik van het feit dat sommige proteïnen een
zeer hoge affiniteit hebben voor specifieke moleculen (=liganden). Als men dus weet voor welke
specifieke moleculen het gezochte proteïnen een hoge affiniteit heeY is het makkelijk om het
gezochten proteïnen te filteren uit een oplossing.
6: ultracentrifuga'e: hier kunnen moleculen gescheiden worden op basis van massa en dichtheid,
doordat het zich gaat bewegen doorheen een vloeistof 'jdens centrifuge. De maat van beweging
wordt gekwan'ficeerd door de sedimenta'ecoëfficient (S), hoe lager deze is hoe trager het
moleculen zich door de vloeistof beweegt 'jdens centrifugeren. De sedimenta'ecoëff is vooral
an[ankelijk v/d massa en de vorm/grooIe v/d moleculen. Algemeen gaan moleculen met een
hogere massa ook een hogere sed. coëff. hebben en moleculen die een meer ronde structuur
hebben gaan een hogere sed. coëff. hebben dan moleculen met een uitgerekte structuur.
(1 − 𝑣𝜌)
𝑆=𝑚∗ 𝑚𝑒𝑡 𝑓 = 𝑓𝑟𝑖𝑐𝑡𝑖𝑒 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑓, 𝑣 = 𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑒𝑘 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑒𝑒𝑙𝑡𝑗𝑒, 𝜌 = 𝑑𝑖𝑐ℎ𝑡𝑒𝑖𝑑
𝑓
(1𝑆 = 10!"# 𝑠)
Om te weten of zuivering een succes was: (per zuiveringstap moet
specifieke ac@viteit van gezochten proteïne s@jgen)
1: Agarose gel elektroforse: Een moleculen met een neIo lading gaat zich doorheen een elektrisch
veld bewegen, bij agarose gel elektroforose wordt gebruikt gemaakt van deze eigenschap. Door een
elektrisch veld aan te leggen op een agarose gel met de nega'eve pool aan de bovenkant en de
posi'eve aan de bodem, de proteïnen oplossing wordt eerst gemengd met SDS, wat als anionische
detergent gaat dienen, deze SDS zorgt dat de proteïnen denatureren zodat ze allemaal een neIo
nega'eve lading gaan krijgen die direct propor'oneel gaat zijn met hun grooIe, aangezien alle
proteine nu een neIo nega'eve lading hebben gaan ze naar de posi'eve pool (bodem) migreren,
echter de grotere moleculen gaan moeilijker migreren dan de kleinere, zo krijgt men een scheiding
op basis van grooIe. Om deze scheiding te visualiseren door een kleurstof zoals Coomassie blauw
toe te voegen. Deze techniek wordt ookwel SDS-PAGE genoemd (polyacrylamide gel elektroforose)
2: Isoelektric focusing: hier worden proteïnen gescheiden o.b.v hun isoelektrisch punt (= de pH
waarde waarbij het proteïnen een neIo lading heeY van 0). Hier wordt een elektroforose ,in een pH
gradiënt, gedaan zonder eerst het toevoegen van SDS. De toegevoegde proteïnen gaan dan
doorheen de pH gradiënt bewegen tot ze op een punt komen waar de pH overeenkomt met hun
isoelektrisch punt.
,3: 2-dimensionale elektroforose is een combina'e van agarose gel en isoelektric.
An@bodies:
Het immuunsysteem beschermt ons van kwaadaardige cellen, om dit te kunnen doen moet ons
lichaam instaat zijn om deze cellen te iden'ficeren. Ons adap'ef immuunsysteem kan specifieke
pathogenen aanvallen zelfs als ze die nog nooit is tegengekomen, het adap'ef immuunsysteem (AIS)
is op te delen in 2 parrallellen maar gerelateerde systemen: humoral en cellular. Bij humoral is de
werkende component de an'bodies (vinden en markeren kwaadaardige cellen), bij cellular de killer T
cellen (vernietegen alle cellen die zijn overgenomen door pathogenen). Meeste an'bodies zijn
gelijkaardig met uitzondering op 3 strengen van ong 7-12 AZ die de hypervariabelen regio’s vormen.
Moleculen die een immuun responds induceren worden an'genen (zijn dus moleculen die aan de
opp van pathogenen ziIen) genoemd. Elke an'bodie bestaat uit 4 ketens:
2 zware ketens die elks bestaan uit 4 immunoglobine domeinen en 2 lichte ketens die elk bestaan uit
2 immunoglobine domeinen dus in totaal bevat een an'bodie 12 domeinen. De 2 zware ketens zijn
aan elkaar verbonden door een disulfide bond (S-S) en elke zware keten is opzich gebonden aan 1
lichte keten ook dmv een disulfide bond. Wat speciaal is aan een an'bodie is dat de 3 hypervariabele
regio’s per domein zich aan de buitekant gaan bevinden zodat in totaal langs beide kanten 6
hypervariabele loops bevinden die dan kunnen binden op een bepaalde proteïnen. Het an'bodie
heeY 2 Fab armen en 1 Fc arm; de Fab armen gaan binden op de an'gen
Terwijl de Fc arm gaat dienen als verstevigingstructuur zowel als
Target voor specifieke proteïnen, zo kan de Fc arm ervoor zorgen dat
Het an'gen gelinkt wordt met andere cellen die gaan helpen het an'gen
Te vernietegen, het heeY 2 Fab armen zodat het steviger kan binden
Aan de an'genen.
ELISA: (Enzym Linked Immunosorbent Assay):
ELISA is een techniek om een specifiek proteïnen te detecteren door gebruik te maken van
an'bodies. Door een enzym, dat gaat reageren met een kleurloos product om iets te produceren dat
wel een kleur heeY, covalent te binden aan een specifiek an'body dat het doelwit an'gen gaat
herkennen. Als dit an'gen aanwezig is gaat het an'bodie daarop binden en gaat het gebonden
enzym da reac'e van kleurloos à kleur katalyseren dus als de oplossing verkleurt is het an'gen
aanwezig. Er kunen zowel polyclonal als monoclonal an'bodies gebruikt worden hiervoor, al is het
logisch dat monoclonal meer betrouwbare resultaten gaat opleveren.
, Pep@de sequencing:
De voornaamste manier is Edman degrada*on dit is een cyclisch proces
waarbij het N-terminale AZ gelabeld wordt door Phenyl isothiocyanaat na
klieving resteerd er dan de polypep'de zonder zijn N-terminale AZ + PTH-AZ
derivaat. Dit proces herhaalt zich dan tot de gewenste pep'deketen overblijY
of de volledige keten is afgebroken tot afzonderlijke AZ. Polypep'des die
gelinked zijn door disulfide ketens kunnen uit elkaar worden getrokken en
gesequeneerd worden
Een pep'de binding is een covalente binding tussen de COO- groep van 1 AZ
met de NH2 groep van een ander AZ
DNA en RNA:
DNA en RNA zijn polymeren waarbij elke monomeer een nucleo*de is. Een nucleo'de bestaat uit 3
dingen: een suiker (deoxyribose bij DNA en ribose bij RNA), een fosfaatgroep (nega'ef geladen, is
cruciaal voor behouden van structuur) en een base. Er zijn 5 soorten bases waarbij Adenine, Guanine
(allebei derivaten van Purine) en Cytosine aanwezig zijn bij zowel DNA en RNA terwijl dat Thymine
enkel aanwezig is bij DNA en Urical enkel bij RNA
(alle 3 derivaten van pyrimidine). Bij de Purines
gaat de N op posi'e 9 binden met de C op
posi'e 1van de suiker, hierbij splitst water af
Analoog voor de Pyrimidines en N op posi'e 1
DNA komt voor in de vorm van een dubbel-
strengige helix waarbij de 2 stregen an'-
parrallel tegen over elkaar, net zodat het
suiker-fosfaat skelet langs buiten ligt en de
bases langs binnen liggen waarbij G-C(3)
en A-T (2) onderling waterstomruggen gaan vormen
2 opeenvolgende bases liggen 3,4 A# van elkaar en per base draait de helix met 36°, 2 opeenvolgende
gelijke delen liggen 34 A# van elkaar en de diameter van de helix is 20 A# . waarbij 1 A# = 10-10
DNA kan circulair of supercoiled zijn, bij supercoiled gaat de helix nog verder rond zijn eigen as
draaien omzo een nog compactere structuur te verkrijgen.
Base-stacking:
In een dubbele helix gaan de VDW krachten zorgen voor base stacking, hierbij worden de bases
parrallell op elkaar gestapeld met een typische afstand van 3,4 Å tussen de 2 bases en ong 3,6 Å
Zuiveringsmethodes voor proteïnen:
1: Sal'ng out: Door toevoeging van een zout zal de zoutconcentra'e s'jgen en worden proteïne
minder oplosbaar, de zoutconcentra'e waarbij een proteïnen uit de oplossing valt hangt af van welk
proteïnen, dus kan het gebruikt worden al een scheidingsmethoden. Het is een rela'ef simpele
methoden en kan best gebruikt worden als ini'ële stap voordat men meer geavanceerde technieken
gaat gebruiken, het zout kan nadien eruit gefilterd worden door dialyse
2: Dialyse: Door een oplossing in een zak te steken met en semipermeabele wand kan dialyse
kleinere moleculen (zoals zouten en ionen) scheiden van grotere moleculen (zoals proteïnen).
Dit komt omdat de dialyse zak wordt geplaatst in een bufferoplossing waarin zich geen kleine
moleculen bevinden. De moleculen die kleiner zijn dan de poriën in de dialyse zak gaan dan naar het
buffermengsel migreren terwijl de grotere moleculen in de zak gaan ziIen, na verloop van 'jd
bevinden er zich enkel nog de grotere moleculen in de zak en kan deze uit de buffer worden gehaald.
3: gel-filtra'e chromatography: een preciezere methoden van scheiding van moleculen o.b.v. hun
grooIe; door een sample vanboven op een kolom, die gevuld is met een gel (bv agarose), te plaatsen
gaan de moleculen gescheiden kunnen worden. Dit omdat het gel gevuld is met poreuze beads,
kleinre moleculen gaan zich dan in of doorheen deze beads bevinden wat hun migra'e naar de
,bodem vertraagd, terwijl grotere moleculen niet in de beads geraken en dus sneller migreren naar de
bodem, zo krijgt men een scheiding v/d moleculen o.b.v. hun grooIe.
4: Ion-exchange chromatography: als men een hoge zuiverheid wenst is aangeraden om meerdere
chromatografien toe te passen, Waarbij de gel chrom de molecule ging sorteren op grooIe gaat de
ion-exch chrom de moleculen sorteren o.b.v. zijn neIo lading bij een bepaalde pH waarde.
Dit is op te delen in 2 mogelijkheden: Ca'on- en Anion-exchange chromatography. Bij de ca'on-
exchange zijn er beads met een nega'eve lading in het gel waardoor alle posi'ef geladen deeltjes
gaan binden en alle nega'eve deeltjes direct naar de bodem zakken, de nega'eve deeltjes kunnen er
dan uitgefilterd worden. Nadien gaan de deeltjes met de kleinste neIo posi'eve lading als eerst naar
beneden zakken, met de grootste neIo posi'eve ladingen als laatste naar beneden, zo krijgt men
een verdeling o.b.v. de grooIe v/d neIo posi'eve lading. Analoog voor de Anion-exch.
5: affiniteit chromatography: deze techniek maakt gebruik van het feit dat sommige proteïnen een
zeer hoge affiniteit hebben voor specifieke moleculen (=liganden). Als men dus weet voor welke
specifieke moleculen het gezochte proteïnen een hoge affiniteit heeY is het makkelijk om het
gezochten proteïnen te filteren uit een oplossing.
6: ultracentrifuga'e: hier kunnen moleculen gescheiden worden op basis van massa en dichtheid,
doordat het zich gaat bewegen doorheen een vloeistof 'jdens centrifuge. De maat van beweging
wordt gekwan'ficeerd door de sedimenta'ecoëfficient (S), hoe lager deze is hoe trager het
moleculen zich door de vloeistof beweegt 'jdens centrifugeren. De sedimenta'ecoëff is vooral
an[ankelijk v/d massa en de vorm/grooIe v/d moleculen. Algemeen gaan moleculen met een
hogere massa ook een hogere sed. coëff. hebben en moleculen die een meer ronde structuur
hebben gaan een hogere sed. coëff. hebben dan moleculen met een uitgerekte structuur.
(1 − 𝑣𝜌)
𝑆=𝑚∗ 𝑚𝑒𝑡 𝑓 = 𝑓𝑟𝑖𝑐𝑡𝑖𝑒 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑓, 𝑣 = 𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑒𝑘 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑒𝑒𝑙𝑡𝑗𝑒, 𝜌 = 𝑑𝑖𝑐ℎ𝑡𝑒𝑖𝑑
𝑓
(1𝑆 = 10!"# 𝑠)
Om te weten of zuivering een succes was: (per zuiveringstap moet
specifieke ac@viteit van gezochten proteïne s@jgen)
1: Agarose gel elektroforse: Een moleculen met een neIo lading gaat zich doorheen een elektrisch
veld bewegen, bij agarose gel elektroforose wordt gebruikt gemaakt van deze eigenschap. Door een
elektrisch veld aan te leggen op een agarose gel met de nega'eve pool aan de bovenkant en de
posi'eve aan de bodem, de proteïnen oplossing wordt eerst gemengd met SDS, wat als anionische
detergent gaat dienen, deze SDS zorgt dat de proteïnen denatureren zodat ze allemaal een neIo
nega'eve lading gaan krijgen die direct propor'oneel gaat zijn met hun grooIe, aangezien alle
proteine nu een neIo nega'eve lading hebben gaan ze naar de posi'eve pool (bodem) migreren,
echter de grotere moleculen gaan moeilijker migreren dan de kleinere, zo krijgt men een scheiding
op basis van grooIe. Om deze scheiding te visualiseren door een kleurstof zoals Coomassie blauw
toe te voegen. Deze techniek wordt ookwel SDS-PAGE genoemd (polyacrylamide gel elektroforose)
2: Isoelektric focusing: hier worden proteïnen gescheiden o.b.v hun isoelektrisch punt (= de pH
waarde waarbij het proteïnen een neIo lading heeY van 0). Hier wordt een elektroforose ,in een pH
gradiënt, gedaan zonder eerst het toevoegen van SDS. De toegevoegde proteïnen gaan dan
doorheen de pH gradiënt bewegen tot ze op een punt komen waar de pH overeenkomt met hun
isoelektrisch punt.
,3: 2-dimensionale elektroforose is een combina'e van agarose gel en isoelektric.
An@bodies:
Het immuunsysteem beschermt ons van kwaadaardige cellen, om dit te kunnen doen moet ons
lichaam instaat zijn om deze cellen te iden'ficeren. Ons adap'ef immuunsysteem kan specifieke
pathogenen aanvallen zelfs als ze die nog nooit is tegengekomen, het adap'ef immuunsysteem (AIS)
is op te delen in 2 parrallellen maar gerelateerde systemen: humoral en cellular. Bij humoral is de
werkende component de an'bodies (vinden en markeren kwaadaardige cellen), bij cellular de killer T
cellen (vernietegen alle cellen die zijn overgenomen door pathogenen). Meeste an'bodies zijn
gelijkaardig met uitzondering op 3 strengen van ong 7-12 AZ die de hypervariabelen regio’s vormen.
Moleculen die een immuun responds induceren worden an'genen (zijn dus moleculen die aan de
opp van pathogenen ziIen) genoemd. Elke an'bodie bestaat uit 4 ketens:
2 zware ketens die elks bestaan uit 4 immunoglobine domeinen en 2 lichte ketens die elk bestaan uit
2 immunoglobine domeinen dus in totaal bevat een an'bodie 12 domeinen. De 2 zware ketens zijn
aan elkaar verbonden door een disulfide bond (S-S) en elke zware keten is opzich gebonden aan 1
lichte keten ook dmv een disulfide bond. Wat speciaal is aan een an'bodie is dat de 3 hypervariabele
regio’s per domein zich aan de buitekant gaan bevinden zodat in totaal langs beide kanten 6
hypervariabele loops bevinden die dan kunnen binden op een bepaalde proteïnen. Het an'bodie
heeY 2 Fab armen en 1 Fc arm; de Fab armen gaan binden op de an'gen
Terwijl de Fc arm gaat dienen als verstevigingstructuur zowel als
Target voor specifieke proteïnen, zo kan de Fc arm ervoor zorgen dat
Het an'gen gelinkt wordt met andere cellen die gaan helpen het an'gen
Te vernietegen, het heeY 2 Fab armen zodat het steviger kan binden
Aan de an'genen.
ELISA: (Enzym Linked Immunosorbent Assay):
ELISA is een techniek om een specifiek proteïnen te detecteren door gebruik te maken van
an'bodies. Door een enzym, dat gaat reageren met een kleurloos product om iets te produceren dat
wel een kleur heeY, covalent te binden aan een specifiek an'body dat het doelwit an'gen gaat
herkennen. Als dit an'gen aanwezig is gaat het an'bodie daarop binden en gaat het gebonden
enzym da reac'e van kleurloos à kleur katalyseren dus als de oplossing verkleurt is het an'gen
aanwezig. Er kunen zowel polyclonal als monoclonal an'bodies gebruikt worden hiervoor, al is het
logisch dat monoclonal meer betrouwbare resultaten gaat opleveren.
, Pep@de sequencing:
De voornaamste manier is Edman degrada*on dit is een cyclisch proces
waarbij het N-terminale AZ gelabeld wordt door Phenyl isothiocyanaat na
klieving resteerd er dan de polypep'de zonder zijn N-terminale AZ + PTH-AZ
derivaat. Dit proces herhaalt zich dan tot de gewenste pep'deketen overblijY
of de volledige keten is afgebroken tot afzonderlijke AZ. Polypep'des die
gelinked zijn door disulfide ketens kunnen uit elkaar worden getrokken en
gesequeneerd worden
Een pep'de binding is een covalente binding tussen de COO- groep van 1 AZ
met de NH2 groep van een ander AZ
DNA en RNA:
DNA en RNA zijn polymeren waarbij elke monomeer een nucleo*de is. Een nucleo'de bestaat uit 3
dingen: een suiker (deoxyribose bij DNA en ribose bij RNA), een fosfaatgroep (nega'ef geladen, is
cruciaal voor behouden van structuur) en een base. Er zijn 5 soorten bases waarbij Adenine, Guanine
(allebei derivaten van Purine) en Cytosine aanwezig zijn bij zowel DNA en RNA terwijl dat Thymine
enkel aanwezig is bij DNA en Urical enkel bij RNA
(alle 3 derivaten van pyrimidine). Bij de Purines
gaat de N op posi'e 9 binden met de C op
posi'e 1van de suiker, hierbij splitst water af
Analoog voor de Pyrimidines en N op posi'e 1
DNA komt voor in de vorm van een dubbel-
strengige helix waarbij de 2 stregen an'-
parrallel tegen over elkaar, net zodat het
suiker-fosfaat skelet langs buiten ligt en de
bases langs binnen liggen waarbij G-C(3)
en A-T (2) onderling waterstomruggen gaan vormen
2 opeenvolgende bases liggen 3,4 A# van elkaar en per base draait de helix met 36°, 2 opeenvolgende
gelijke delen liggen 34 A# van elkaar en de diameter van de helix is 20 A# . waarbij 1 A# = 10-10
DNA kan circulair of supercoiled zijn, bij supercoiled gaat de helix nog verder rond zijn eigen as
draaien omzo een nog compactere structuur te verkrijgen.
Base-stacking:
In een dubbele helix gaan de VDW krachten zorgen voor base stacking, hierbij worden de bases
parrallell op elkaar gestapeld met een typische afstand van 3,4 Å tussen de 2 bases en ong 3,6 Å
