Inleiding microscopie:
1) Wat bepaalt het oplossend vermogen van een microscoop? Vergelijk
lichtmicroscopie (LM) met elektronenmicroscopie (EM)! Wat is de praktische
resolutie?
Oplossend vermogen/resolutie is de kleinste afstand waarmee 2 punten nog net afzonderlijk
waargenomen kunnen worden, bij een kleinere afstand kunnen de punten niet meer van elkaar
onderscheiden worden. Het oplossend vermogen van de licht microscoop is 0,2 µm en dat van
de elektronenmicroscoop 0,1 nm.
De formule is R = λ/NA , waarbij λ staat voor golflengte en NA = numerieke apertuur/
kwaliteitswaardemeter objectief: NA= n x sinµ. N staat voor de brekingsindex van het medium
en µ voor de halve tophoek van de apertuurkegel. Hoeken van 90° kunnen niet worden
opgevangen omdat de sinus dan gelijk is aan 1 en NA bij droge lenzen altijd kleiner is dan 1.
Hoe hoger de NA/ hoe kleiner λ, hoe beter de resolutie. De resolutie van de
elektronenmicroscoop is dus beter omdat de golflengte van elektronen = 0,005 nm kleiner is
dan die van de lichtmicroscoop = 400 – 700 nm.
De praktische resolutie is de maximale vergroting waarvoor nog een scherp beeld zichtbaar is.
Deze is niet altijd gelijk aan de theoretische resolutie omdat resolutie wordt beïnvloed door de
kwaliteit van de preparaten, de aanwezigheid van artefacten, de dikte van de coupes, de
kwaliteit van de gebruikte lenzen, de kwaliteit van de gebruikte lichtbron, …
2) Wat is een dichroïsche spiegel, hoe werkt het principe en in welke soort
microscopie wordt dit gebruikt?
Een dichroïsche spiegel is een spiegel die gebruikt wordt bij fluorescentiemicroscopie. Door de
spiegel onder een hoek van 45° ten opzichte van de invallende lichtstraal te plaatsen zal het
excitatie- en emissielicht van elkaar gescheiden kunnen worden. Het excitatielicht is het licht
dat gebruikt wordt om een stof in een hogere energietoestand te krijgen = excitatie toestand.
Het emissielicht is het licht dat uitgezonden wordt nadat de stof in geëxciteerde toestand
kwam en energie afgegeven heeft.
Als we een spiegel voor golflengte 510 nm plaatsen achter een excitatiefilter voor blauw licht
zal de spiegel al het licht met een golflengte korter dan 510 nm reflecteren/afbuigen onder een
hoek van 90° naar het preparaat. Het licht met golflengte langer dan 510 nm wordt
doorgelaten. Het weerkaatste licht zal geabsorbeerd worden door fluorochromen in het
preparaat en licht uitzenden met een langere golflengte, in dit geval groen licht dat wel
doorgelaten wordt door de spiegel en door de sper/emissiefilter gaat waarna het door de
oculairen zal worden opgevangen.
3) Vergelijk de voorbereidingsprotocols voor weefsels bedoeld voor lichtmicroscopie
en voor transmissie elektronen microscopie.
Bij een lichtmicroscoop heb je weefselcoupes nodig en bij een transmissie
elektronenmicroscoop weefselblokjes van maximaal 1mm3. Deze worden gemaakt van organen
die gefixeerd worden door perfusie of immersie zodat degradatie van het weefsel wordt
tegengegaan. Bij perfusie wordt het fixatief via de bloedbaan binnengebracht en bij immersie
wordt het weefsel na verwijdering ondergedompeld in een bad fixatief zodat het in het weefsel
binnendringt. Het gebruikte fixatief bij lichtmicroscopie is paraformaldehyde en bij de
transmissie elektronen microscoop glutaraldehyde.
Na fixatie wordt het weefsel voor de lichtmicroscoop gespoeld en gedehydrateerd in een aantal
baden met ethanol. De concentratie van ethanol neemt per bad toe. Het weefselblokje wordt
ingebed in paraffine om het stevig en snijdbaar te maken zodat het met een microtoom in
dunne coupes van 2-7 µm gesneden kan worden. Deze coupes worden opgevangen op een
droogglaasje. Vervolgens wordt de coupe gedeparaffineerd met xyleen en opnieuw in waterig
milieu gebracht door middel van rehydratatie. De coupe wordt in verschillende baden ethanol
gelegd met een afname in concentratie zodat ze gekleurd kunnen worden. Na de kleuring vindt
,een nieuwe dehydratatiereeks plaats waarna de coupe omsloten wordt met een niet-waterig
inbeddingsmedium om zo uitdroging te voorkomen.
Het weefselblokje voor de transmissie elektronenmicroscoop wordt na fixatie een tweede keer
gefixeerd door immersie in osmiumtetroxide. Het blokje wordt hierna gespoeld en
gedehydrateerd in een stijgende alcoholreeks waarna het ingebed wordt in hars met een
hogere hardheid dan parafine. Een ultramicrotoom met glazen of diamanten messen snijdt
coupes van 50 nm. De coupes worden opgevangen op een met draagfilm bedekt koperen
gridje. Nadien volgt contrastatie met zware metalen wat een alternatief vormt voor kleuring
zodat ondanks de grijswaarden verschillende structuren kunnen waargenomen worden.
De preparaten voor een transmissie elektronenmicroscoop kunnen ook gemaakt worden door
middel van vitrificatie = het invriezen in vloeibare stikstof met een snelheid van 10.000°C
zodat kristalvorming voorkomen wordt. Om het weefsel te snijden op kamertemperatuur is
vriessubstitutie nodig
Epitheel:
4) Bespreek de opbouw van een epitheelcel. Bespreek de verschillende celdomeinen
en de betrokken specialisaties.
De epitheelcel is een gepolariseerde cel die georganiseerd wordt in weefsels die het
lichaamsoppervlak bedekken, holten en kanalen in het lichaam aflijnen en klieren vormen om
onderliggende weefsels tegen invloeden van buitenaf te beschermen.
Het apicale domein staat in contact met het lumen en kan microvilli, stereocilia, cilia of
flagellen bevatten.
Microvilli zijn uitstulpingen van het celoppervlak die zorgen voor een oppervlaktevergroting. Ze
worden ondersteund door actinefilamenten en komen voornamelijk voor in resorberende cellen.
Stereocilia zijn lange microvilli waarvan de ondersteuning van de actinefilamenten minder goed
ontwikkeld is waardoor ze minder stabiel zijn. Ze zijn onbeweeglijk en betrokken bij absorptie.
Cilia zijn trilharen die door het groeien en krimpen van microtubuli in een axonema/9+2
structuur (9 doubletten en 1 centrale) een gecoördineerde slagbeweging hebben. Deze
slagbeweging zorgt voor het voortdrijven van vloeistoffen of slijm.
Flagellen zijn zweepstaarten die alleen bij spermatozoa voorkomen en ook een axonema
structuur heeft. De energie voor de golfbeweging om zich voort te bewegen komt van
mitochondriën.
Het laterale domein bevat intercellulaire verbindingen en zorgt voor communicatie tussen de
aangrenzende cellen. De verbindingen zijn onder te verdelen in verschillende types: macula
zijn ronde/puntvormige verbindingen, zonula zijn bandvormige verbindingen en
nexusverbindingen zorgen voor communicatie.
Tight junctions/zonula occludens vormen dankzij claudine en occludine een afsluitende
verbinding tussen de celmembranen waardoor doorstroom onmogelijk is. De buitenbladen van
de celmembranen van naastliggende cellen zijn met elkaar versmolten waardoor paracellulair
transport langs en tussen de cellen onmogelijk is.
Adhaerensverbindingen/zonula adhaerens zijn verbindingen waarbij cateninen zorgen voor
binding van cadherine-eiwitten aan actinefilamenten met contractiele eigenschappen van
naburige cellen waardoor een bandvormige zone in het apicale celdeel ontstaat.
Desmosomen/macula adhaerens zijn verbindingen waarbij hechtingseiwitten tussen cadherines
en intermediaire filamenten een elektronendichte intracellulaire plaque vormen die 2
epitheelcellen aan elkaar hecht door middel van een ritssluiting.
Gap junctions/nexus verbinding zijn kanalen die zorgen voor de directe uitwisseling van ionen
en kleine moleculen om zo voor intercellulaire communicatie te zorgen.
, Het basale domein zorgt voor verankering van de cel aan het basaalmembraan tussen het
epitheel en het onderliggend bindweefsel.
Hemidesmosomen/halve desmosomen zorgen voor de verankering van epitheelcellen aan de
lamina basalis via integrines.
Het basaal membraan bestaat uit een lamina lucida en densa die samen de lamina basalis
vormen en uit de lamina reticularis. Deze bestaan uit bindweefsel- en epitheelcellen en
functioneren als steunstructuur, filter en aanhechtingsoppervlak.
5) Bespreek meerlagig verhoornd plaveiselepitheel op LM en EM niveau
Meerlagig verhoornd plaveiselepitheel is een epitheel dat uit meerdere lagen, die onderling
verbonden zijn via desmosomen, bestaat en keratinefilamenten bevat. De bovenste lagen van
het epitheel zijn verhoornd en bestaan dus uit dode cellen. De cellen die aan het oppervlak
gelegen zijn, zijn plaveiselcellen. Deze cellen zijn afgeplat en hebben een ovale, platgedrukte
kern waarvan de lange zijde evenwijdig is met het basaalmembraan.
Het stratum basale is gelegen op het basaal membraan tussen epitheel en onderliggend
bindweefsel. Deze laag bevat delende stamcellen die voor vernieuwing van het epitheel zorgen
door de bovenliggende cellagen naar boven te duwen.
Het stratum spinosum is de laag boven het stratum basale. De keratinefilamenten bundelen
samen tot tonofibrillen zodat een vast geheel ontstaat. Preparatie van deze cellaag zorgt
ervoor dat de cellen krimpen waardoor het lijkt dat de cellen stekels/spina hebben.
Het stratum granulosum bevat keratohyaliene korrels met filaggrine. Het filaggrine zorgt voor
de aggregatie van keratinefilamenten waardoor gecrosslinkte tonofilamenten ontstaan. Er zijn
ook membrane coating granules/Odland bodies met een lipidenrijke inhoud aanwezig. Contact
met het celmembraan zorgt ervoor dat de inhoud vrijkomt via exocytose en een
waterafstotende laag wordt gevormd.
Stratum lucidum is een dunne en doorzichtige laag van dode cellen zonder kern die enkel
aanwezig is in dikke, onbehaarde huid.
Stratum corneum ontstaat door dat het water met voedingsstoffen niet verder kan
doordringen. De, met keratinefilamenten gevulde, cellen zullen bijgevolg afsterven en de
keratinocyten zetten eiwitten af waardoor een ondoordringbare cornified envelope ontstaat.
Deze laag zorgt ervoor dat celdood versneld wordt en dat celkernen uit de bovenste lagen
verdwijnen.
Onder de lichtmicroscoop zijn de verschillende lagen van het meerlagig verhoornd
plaveiselepitheel duidelijk te onderscheiden op basis van celvorm, kleuring en keratinisatie.
Ultra structurele details zoals desmosomen, keratohyaliene korrels, Odland bodies, spina en de
cornified envelope zijn enkel zichtbaar bij de transmissie elektronenmicroscoop.
6) Bespreek de opbouw van een meerlagig onverhoornd plaveiselepitheel en geef de
verschillen met een verhoornd meerlagig plaveiselepitheel.
Meerlagig onverhoornd plaveiselepitheel verschilt van verhoornd in de afwezigheid van het
stratum granulosum. Omdat deze laag ontbreekt wordt er geen waterafstotende laag gevormd.
De cellen in de bovenste cellagen kunnen nog wel voedingsstoffen opnemen en vormen het
stratum superficiale in plaats van het stratum corneum. Bij een onverhoornd epitheel is het
oppervlak vochtig en bij verhoornd epitheel is het droog. Ook het stratum lucidum is alleen
aanwezig bij sterk verhoornd epitheel. Zie vraag 5 voor de verschillende lagen.
7) Bespreek de indeling van de klierepithelen.
Klierepithelen worden ingedeeld op basis van ontstaanswijze, microscopische bouw, type
secreet en de wijze waarop secretieproducten het lichaam verlaten.
Exocriene klieren ontstaan door proliferatie en uitstulping van het bedekkende epitheel, hun
secreet wordt via afvoergangen naar de buitenwereld afgevoerd. Bloedvaten zorgen voor de
voorziening van zuurstof en voedingsstoffen van de organen.
1) Wat bepaalt het oplossend vermogen van een microscoop? Vergelijk
lichtmicroscopie (LM) met elektronenmicroscopie (EM)! Wat is de praktische
resolutie?
Oplossend vermogen/resolutie is de kleinste afstand waarmee 2 punten nog net afzonderlijk
waargenomen kunnen worden, bij een kleinere afstand kunnen de punten niet meer van elkaar
onderscheiden worden. Het oplossend vermogen van de licht microscoop is 0,2 µm en dat van
de elektronenmicroscoop 0,1 nm.
De formule is R = λ/NA , waarbij λ staat voor golflengte en NA = numerieke apertuur/
kwaliteitswaardemeter objectief: NA= n x sinµ. N staat voor de brekingsindex van het medium
en µ voor de halve tophoek van de apertuurkegel. Hoeken van 90° kunnen niet worden
opgevangen omdat de sinus dan gelijk is aan 1 en NA bij droge lenzen altijd kleiner is dan 1.
Hoe hoger de NA/ hoe kleiner λ, hoe beter de resolutie. De resolutie van de
elektronenmicroscoop is dus beter omdat de golflengte van elektronen = 0,005 nm kleiner is
dan die van de lichtmicroscoop = 400 – 700 nm.
De praktische resolutie is de maximale vergroting waarvoor nog een scherp beeld zichtbaar is.
Deze is niet altijd gelijk aan de theoretische resolutie omdat resolutie wordt beïnvloed door de
kwaliteit van de preparaten, de aanwezigheid van artefacten, de dikte van de coupes, de
kwaliteit van de gebruikte lenzen, de kwaliteit van de gebruikte lichtbron, …
2) Wat is een dichroïsche spiegel, hoe werkt het principe en in welke soort
microscopie wordt dit gebruikt?
Een dichroïsche spiegel is een spiegel die gebruikt wordt bij fluorescentiemicroscopie. Door de
spiegel onder een hoek van 45° ten opzichte van de invallende lichtstraal te plaatsen zal het
excitatie- en emissielicht van elkaar gescheiden kunnen worden. Het excitatielicht is het licht
dat gebruikt wordt om een stof in een hogere energietoestand te krijgen = excitatie toestand.
Het emissielicht is het licht dat uitgezonden wordt nadat de stof in geëxciteerde toestand
kwam en energie afgegeven heeft.
Als we een spiegel voor golflengte 510 nm plaatsen achter een excitatiefilter voor blauw licht
zal de spiegel al het licht met een golflengte korter dan 510 nm reflecteren/afbuigen onder een
hoek van 90° naar het preparaat. Het licht met golflengte langer dan 510 nm wordt
doorgelaten. Het weerkaatste licht zal geabsorbeerd worden door fluorochromen in het
preparaat en licht uitzenden met een langere golflengte, in dit geval groen licht dat wel
doorgelaten wordt door de spiegel en door de sper/emissiefilter gaat waarna het door de
oculairen zal worden opgevangen.
3) Vergelijk de voorbereidingsprotocols voor weefsels bedoeld voor lichtmicroscopie
en voor transmissie elektronen microscopie.
Bij een lichtmicroscoop heb je weefselcoupes nodig en bij een transmissie
elektronenmicroscoop weefselblokjes van maximaal 1mm3. Deze worden gemaakt van organen
die gefixeerd worden door perfusie of immersie zodat degradatie van het weefsel wordt
tegengegaan. Bij perfusie wordt het fixatief via de bloedbaan binnengebracht en bij immersie
wordt het weefsel na verwijdering ondergedompeld in een bad fixatief zodat het in het weefsel
binnendringt. Het gebruikte fixatief bij lichtmicroscopie is paraformaldehyde en bij de
transmissie elektronen microscoop glutaraldehyde.
Na fixatie wordt het weefsel voor de lichtmicroscoop gespoeld en gedehydrateerd in een aantal
baden met ethanol. De concentratie van ethanol neemt per bad toe. Het weefselblokje wordt
ingebed in paraffine om het stevig en snijdbaar te maken zodat het met een microtoom in
dunne coupes van 2-7 µm gesneden kan worden. Deze coupes worden opgevangen op een
droogglaasje. Vervolgens wordt de coupe gedeparaffineerd met xyleen en opnieuw in waterig
milieu gebracht door middel van rehydratatie. De coupe wordt in verschillende baden ethanol
gelegd met een afname in concentratie zodat ze gekleurd kunnen worden. Na de kleuring vindt
,een nieuwe dehydratatiereeks plaats waarna de coupe omsloten wordt met een niet-waterig
inbeddingsmedium om zo uitdroging te voorkomen.
Het weefselblokje voor de transmissie elektronenmicroscoop wordt na fixatie een tweede keer
gefixeerd door immersie in osmiumtetroxide. Het blokje wordt hierna gespoeld en
gedehydrateerd in een stijgende alcoholreeks waarna het ingebed wordt in hars met een
hogere hardheid dan parafine. Een ultramicrotoom met glazen of diamanten messen snijdt
coupes van 50 nm. De coupes worden opgevangen op een met draagfilm bedekt koperen
gridje. Nadien volgt contrastatie met zware metalen wat een alternatief vormt voor kleuring
zodat ondanks de grijswaarden verschillende structuren kunnen waargenomen worden.
De preparaten voor een transmissie elektronenmicroscoop kunnen ook gemaakt worden door
middel van vitrificatie = het invriezen in vloeibare stikstof met een snelheid van 10.000°C
zodat kristalvorming voorkomen wordt. Om het weefsel te snijden op kamertemperatuur is
vriessubstitutie nodig
Epitheel:
4) Bespreek de opbouw van een epitheelcel. Bespreek de verschillende celdomeinen
en de betrokken specialisaties.
De epitheelcel is een gepolariseerde cel die georganiseerd wordt in weefsels die het
lichaamsoppervlak bedekken, holten en kanalen in het lichaam aflijnen en klieren vormen om
onderliggende weefsels tegen invloeden van buitenaf te beschermen.
Het apicale domein staat in contact met het lumen en kan microvilli, stereocilia, cilia of
flagellen bevatten.
Microvilli zijn uitstulpingen van het celoppervlak die zorgen voor een oppervlaktevergroting. Ze
worden ondersteund door actinefilamenten en komen voornamelijk voor in resorberende cellen.
Stereocilia zijn lange microvilli waarvan de ondersteuning van de actinefilamenten minder goed
ontwikkeld is waardoor ze minder stabiel zijn. Ze zijn onbeweeglijk en betrokken bij absorptie.
Cilia zijn trilharen die door het groeien en krimpen van microtubuli in een axonema/9+2
structuur (9 doubletten en 1 centrale) een gecoördineerde slagbeweging hebben. Deze
slagbeweging zorgt voor het voortdrijven van vloeistoffen of slijm.
Flagellen zijn zweepstaarten die alleen bij spermatozoa voorkomen en ook een axonema
structuur heeft. De energie voor de golfbeweging om zich voort te bewegen komt van
mitochondriën.
Het laterale domein bevat intercellulaire verbindingen en zorgt voor communicatie tussen de
aangrenzende cellen. De verbindingen zijn onder te verdelen in verschillende types: macula
zijn ronde/puntvormige verbindingen, zonula zijn bandvormige verbindingen en
nexusverbindingen zorgen voor communicatie.
Tight junctions/zonula occludens vormen dankzij claudine en occludine een afsluitende
verbinding tussen de celmembranen waardoor doorstroom onmogelijk is. De buitenbladen van
de celmembranen van naastliggende cellen zijn met elkaar versmolten waardoor paracellulair
transport langs en tussen de cellen onmogelijk is.
Adhaerensverbindingen/zonula adhaerens zijn verbindingen waarbij cateninen zorgen voor
binding van cadherine-eiwitten aan actinefilamenten met contractiele eigenschappen van
naburige cellen waardoor een bandvormige zone in het apicale celdeel ontstaat.
Desmosomen/macula adhaerens zijn verbindingen waarbij hechtingseiwitten tussen cadherines
en intermediaire filamenten een elektronendichte intracellulaire plaque vormen die 2
epitheelcellen aan elkaar hecht door middel van een ritssluiting.
Gap junctions/nexus verbinding zijn kanalen die zorgen voor de directe uitwisseling van ionen
en kleine moleculen om zo voor intercellulaire communicatie te zorgen.
, Het basale domein zorgt voor verankering van de cel aan het basaalmembraan tussen het
epitheel en het onderliggend bindweefsel.
Hemidesmosomen/halve desmosomen zorgen voor de verankering van epitheelcellen aan de
lamina basalis via integrines.
Het basaal membraan bestaat uit een lamina lucida en densa die samen de lamina basalis
vormen en uit de lamina reticularis. Deze bestaan uit bindweefsel- en epitheelcellen en
functioneren als steunstructuur, filter en aanhechtingsoppervlak.
5) Bespreek meerlagig verhoornd plaveiselepitheel op LM en EM niveau
Meerlagig verhoornd plaveiselepitheel is een epitheel dat uit meerdere lagen, die onderling
verbonden zijn via desmosomen, bestaat en keratinefilamenten bevat. De bovenste lagen van
het epitheel zijn verhoornd en bestaan dus uit dode cellen. De cellen die aan het oppervlak
gelegen zijn, zijn plaveiselcellen. Deze cellen zijn afgeplat en hebben een ovale, platgedrukte
kern waarvan de lange zijde evenwijdig is met het basaalmembraan.
Het stratum basale is gelegen op het basaal membraan tussen epitheel en onderliggend
bindweefsel. Deze laag bevat delende stamcellen die voor vernieuwing van het epitheel zorgen
door de bovenliggende cellagen naar boven te duwen.
Het stratum spinosum is de laag boven het stratum basale. De keratinefilamenten bundelen
samen tot tonofibrillen zodat een vast geheel ontstaat. Preparatie van deze cellaag zorgt
ervoor dat de cellen krimpen waardoor het lijkt dat de cellen stekels/spina hebben.
Het stratum granulosum bevat keratohyaliene korrels met filaggrine. Het filaggrine zorgt voor
de aggregatie van keratinefilamenten waardoor gecrosslinkte tonofilamenten ontstaan. Er zijn
ook membrane coating granules/Odland bodies met een lipidenrijke inhoud aanwezig. Contact
met het celmembraan zorgt ervoor dat de inhoud vrijkomt via exocytose en een
waterafstotende laag wordt gevormd.
Stratum lucidum is een dunne en doorzichtige laag van dode cellen zonder kern die enkel
aanwezig is in dikke, onbehaarde huid.
Stratum corneum ontstaat door dat het water met voedingsstoffen niet verder kan
doordringen. De, met keratinefilamenten gevulde, cellen zullen bijgevolg afsterven en de
keratinocyten zetten eiwitten af waardoor een ondoordringbare cornified envelope ontstaat.
Deze laag zorgt ervoor dat celdood versneld wordt en dat celkernen uit de bovenste lagen
verdwijnen.
Onder de lichtmicroscoop zijn de verschillende lagen van het meerlagig verhoornd
plaveiselepitheel duidelijk te onderscheiden op basis van celvorm, kleuring en keratinisatie.
Ultra structurele details zoals desmosomen, keratohyaliene korrels, Odland bodies, spina en de
cornified envelope zijn enkel zichtbaar bij de transmissie elektronenmicroscoop.
6) Bespreek de opbouw van een meerlagig onverhoornd plaveiselepitheel en geef de
verschillen met een verhoornd meerlagig plaveiselepitheel.
Meerlagig onverhoornd plaveiselepitheel verschilt van verhoornd in de afwezigheid van het
stratum granulosum. Omdat deze laag ontbreekt wordt er geen waterafstotende laag gevormd.
De cellen in de bovenste cellagen kunnen nog wel voedingsstoffen opnemen en vormen het
stratum superficiale in plaats van het stratum corneum. Bij een onverhoornd epitheel is het
oppervlak vochtig en bij verhoornd epitheel is het droog. Ook het stratum lucidum is alleen
aanwezig bij sterk verhoornd epitheel. Zie vraag 5 voor de verschillende lagen.
7) Bespreek de indeling van de klierepithelen.
Klierepithelen worden ingedeeld op basis van ontstaanswijze, microscopische bouw, type
secreet en de wijze waarop secretieproducten het lichaam verlaten.
Exocriene klieren ontstaan door proliferatie en uitstulping van het bedekkende epitheel, hun
secreet wordt via afvoergangen naar de buitenwereld afgevoerd. Bloedvaten zorgen voor de
voorziening van zuurstof en voedingsstoffen van de organen.
