GEN- EN CELTECHNOLOGIE
Recombinante DNA technologie ..............................................................................................2
Genoom editing: CRISPR-Cas9 technologie ........................................................................... 11
Basis celcultuur .................................................................................................................... 18
Sterilisatie en desinfectie....................................................................................................... 34
Cel assays............................................................................................................................. 42
Stamcellen............................................................................................................................ 50
Massive parallel sequencing technologies .............................................................................. 60
Gentherapie voor aangeboren ziektes..................................................................................... 68
Reversed genetics met 3’ en 5’ RACE ...................................................................................... 77
Enkel keten antilichamen ....................................................................................................... 80
DNA-gerelateerde technieken ................................................................................................ 88
1
,RECOMBINANTE DNA TECHNOLOGIE
= exogeen DNA
− Gentechnologie: gericht aanpassen van genetische informatie d.m.v.
• Klassieke kruisingsschema’s
o Inteelt vormt pure muizenlijnen: homozygoot voor kenmerken
! ook verhoogde kans op negatieve traits door cosanguiniteit
Genetic engineering
- Sneller en meer betrouwbaar
- Insertie van DNA in acceptor-organisme
= vorming transgene organismen
- Recombinant DNA: hercombineren van DNA uit meerdere bronnen
• Moleculair biologische technieken
− Basismethoden in gen- en celtechnologie
• Gentechnologie
o Isolatie/amplificatie van het gen
o Aanpassen van het gen
o Overbrengen naar een vector
• Celtechnologie
o Transformatie of transfectie/nucleofectie
o Selectie van gemodificeerde cellen/organismen
Basismethoden in gentechnologie
Isolatie/amplificatie van een gen door PCR
− Kloneren van DNA sequentie in een testtube
! 109 kopijen binnen de 2 uur – gedurende 30 cycles
− Componenten
• DNA template: DNA regio die men wenst te amplificeren
• DNA oligonucleotides = primers: complementair aan template
• dNTP = deoxynucleotide trifosfaat
• Mg2+ = divalent kation
• Taq DNA polymerase
− Principe
• Denaturatie
• Annealing: binding van primers
• Elongatie: inbouw van dNTP door Taq DNA polymerase
o Aanbouw op primer aan 3’ uiteinde – werkt richting 5’ uiteinde template
2
,Muteren van een gen door PCR
− Overlap van primers op plaats van gewenste mutatie
− Kleine deletie
• Primers aanbrengen met 3’ overlaps
o Primer C is complementair met 5’ overhang van primer B
o Primer B is complementair met 5’ overhang van primer C
− Grote deletie
• Primer 2 is complementair met primer 3
• Primerdesign
o Primers 1 en 3 = forward: rechtstreeks uit databank
o Primers 2 en 4 = reverse: complement nemen
= 5’ TCC ATT TTG 3’ ➔ 3’ AGG TAA AAC 5’
− Puntmutagenese
• Plaatsen van puntmutaties (verwijderd van 3’) op primers F2 en R1
3
, − Grote insertie
• 5’ overhang van primer B is complementair met 3’ einde antisense streng
• 5’ overhang van primer C is complementair met 3’ einde sense streng
Kloneren van een gen
= overbrengen naar en vermenigvuldigen in een vector
Klassieke cut and paste
− Restrictie-enzymen: bacteriële eiwitten die dsDNA verknipt op specifieke sequenties
• Vormen palindromische DNA sequenties: TTAA en AATT
• Vormen blunt of sticky ends
! Bij gebruik van 2x zelfde restrictie-enzyme is er geen controle op richting van insert
− DNA ligasen: enzymen die fosfodiësterbinding vormen tussen 2 dNTP
• Oorsprong: viraal – bacterieel – van zoogdier
• Meest gebuikte: bacteriofaag T4 ligase
• Efficiëntie
o Insereert niet altijd het insert
o Insereert het insert slechts aan 1 zijde
o Insereert een contaminant
o Vormt van het insert een circularie/lange sequentie
o …
4
Recombinante DNA technologie ..............................................................................................2
Genoom editing: CRISPR-Cas9 technologie ........................................................................... 11
Basis celcultuur .................................................................................................................... 18
Sterilisatie en desinfectie....................................................................................................... 34
Cel assays............................................................................................................................. 42
Stamcellen............................................................................................................................ 50
Massive parallel sequencing technologies .............................................................................. 60
Gentherapie voor aangeboren ziektes..................................................................................... 68
Reversed genetics met 3’ en 5’ RACE ...................................................................................... 77
Enkel keten antilichamen ....................................................................................................... 80
DNA-gerelateerde technieken ................................................................................................ 88
1
,RECOMBINANTE DNA TECHNOLOGIE
= exogeen DNA
− Gentechnologie: gericht aanpassen van genetische informatie d.m.v.
• Klassieke kruisingsschema’s
o Inteelt vormt pure muizenlijnen: homozygoot voor kenmerken
! ook verhoogde kans op negatieve traits door cosanguiniteit
Genetic engineering
- Sneller en meer betrouwbaar
- Insertie van DNA in acceptor-organisme
= vorming transgene organismen
- Recombinant DNA: hercombineren van DNA uit meerdere bronnen
• Moleculair biologische technieken
− Basismethoden in gen- en celtechnologie
• Gentechnologie
o Isolatie/amplificatie van het gen
o Aanpassen van het gen
o Overbrengen naar een vector
• Celtechnologie
o Transformatie of transfectie/nucleofectie
o Selectie van gemodificeerde cellen/organismen
Basismethoden in gentechnologie
Isolatie/amplificatie van een gen door PCR
− Kloneren van DNA sequentie in een testtube
! 109 kopijen binnen de 2 uur – gedurende 30 cycles
− Componenten
• DNA template: DNA regio die men wenst te amplificeren
• DNA oligonucleotides = primers: complementair aan template
• dNTP = deoxynucleotide trifosfaat
• Mg2+ = divalent kation
• Taq DNA polymerase
− Principe
• Denaturatie
• Annealing: binding van primers
• Elongatie: inbouw van dNTP door Taq DNA polymerase
o Aanbouw op primer aan 3’ uiteinde – werkt richting 5’ uiteinde template
2
,Muteren van een gen door PCR
− Overlap van primers op plaats van gewenste mutatie
− Kleine deletie
• Primers aanbrengen met 3’ overlaps
o Primer C is complementair met 5’ overhang van primer B
o Primer B is complementair met 5’ overhang van primer C
− Grote deletie
• Primer 2 is complementair met primer 3
• Primerdesign
o Primers 1 en 3 = forward: rechtstreeks uit databank
o Primers 2 en 4 = reverse: complement nemen
= 5’ TCC ATT TTG 3’ ➔ 3’ AGG TAA AAC 5’
− Puntmutagenese
• Plaatsen van puntmutaties (verwijderd van 3’) op primers F2 en R1
3
, − Grote insertie
• 5’ overhang van primer B is complementair met 3’ einde antisense streng
• 5’ overhang van primer C is complementair met 3’ einde sense streng
Kloneren van een gen
= overbrengen naar en vermenigvuldigen in een vector
Klassieke cut and paste
− Restrictie-enzymen: bacteriële eiwitten die dsDNA verknipt op specifieke sequenties
• Vormen palindromische DNA sequenties: TTAA en AATT
• Vormen blunt of sticky ends
! Bij gebruik van 2x zelfde restrictie-enzyme is er geen controle op richting van insert
− DNA ligasen: enzymen die fosfodiësterbinding vormen tussen 2 dNTP
• Oorsprong: viraal – bacterieel – van zoogdier
• Meest gebuikte: bacteriofaag T4 ligase
• Efficiëntie
o Insereert niet altijd het insert
o Insereert het insert slechts aan 1 zijde
o Insereert een contaminant
o Vormt van het insert een circularie/lange sequentie
o …
4
