Hoofdstuk 3: RNA
RNA extraheren
Stap 1 Lysis
● De cellen met hun membraan errond: moeten kapot gemaakt worden
● De celinhoud komt dan terecht in het lysaat
Manieren voor lyseren:
1. Detergenten: SDS
2. Vriezen en ontdooien: bij het invriezen ontstaan er kristallen. Daarna
ontdooit men weer de cel (kristallen worden groter en groter). Vervolgens
gaat men het terug weer invriezen zodat de kristallen ervoor zorgen dat de
celmembraan kapot wordt gemaakt
3. Mechanische homogenisatie: Mortier met Pestel, Douncer homogenisator
4. Vloeibare (liquid) homogenisatie: Oplossing tussen glazen pestels -> Er zal
turbulentie ontstaan die ervoor dat de cellen kapot gemaakt worden. Dit is
een goede techniek doordat het mild is.
5. Sonicatie: Via hoge geluidsgolven -> Kan ervoor zorgen dat DNA of RNA
gaat fragmenteren
Stap 2 Isoleren
● RNA moet geïsoleerd worden uit het lysaat met de celinhoud
Stap 3 Oplossen of Concentreren
● Na het isoleren van het RNA wordt het opgelost of geconcentreerd (Zelfde
hoeveelheid RNA in een kleiner volume)
, RNA extractie met organische solventen (Trizol)
Principe: Scheiding van RNA, DNA en eiwitten op basis van hun verschillende oplosbaarheid
in verschillende niet-mengbare vloeistoffen
Grote verschil met DNA: Guanidium Thiocyanaat (Zuur) gebruiken
Guanidium Thiocyanaat is ook een RNAse inhibitor -> Handig voor RNA extractie
Stap 1: Eerst doet je Trizol Stap (Homogenisation / Lysering)
Guanidinium thiocyanaat wordt toegevoegd → Breekt de cellen open (Lyseren) en
denatureren eiwitten
Stap 2: Daarna stap van scheiding in verschillende fasen: Chloroform wordt
toegevoegd
→ Chloroform helpt bij het scheiden van DNA, RNA en eiwitten in verschillende lagen
Drie verschillende lagen:
- RNA: Organische fase
- DNA: Interfase
- Eiwitten: Waterige fase
-> Stap 3: Daarna voert men de Ethanolprecipitatie stap uit
Isopropanol wordt toegevoegd.
Die zal ervoor zorgen dat RNA onoplosbaar wordt en in de pellet terecht komt (Het zal
neerslaan)
Stap 4: RNA wassen
● Was het RNA-pellet met 70% ethanol om restanten van zouten en andere
onzuiverheden te verwijderen.
● Droog het RNA-pellet kort (om ethanol te laten verdampen).
Stap 5: RNA oplossen
● Los het RNA-pellet op in water of een speciale buffer (bijvoorbeeld RNAse-vrij
water).
RNA extraheren
Stap 1 Lysis
● De cellen met hun membraan errond: moeten kapot gemaakt worden
● De celinhoud komt dan terecht in het lysaat
Manieren voor lyseren:
1. Detergenten: SDS
2. Vriezen en ontdooien: bij het invriezen ontstaan er kristallen. Daarna
ontdooit men weer de cel (kristallen worden groter en groter). Vervolgens
gaat men het terug weer invriezen zodat de kristallen ervoor zorgen dat de
celmembraan kapot wordt gemaakt
3. Mechanische homogenisatie: Mortier met Pestel, Douncer homogenisator
4. Vloeibare (liquid) homogenisatie: Oplossing tussen glazen pestels -> Er zal
turbulentie ontstaan die ervoor dat de cellen kapot gemaakt worden. Dit is
een goede techniek doordat het mild is.
5. Sonicatie: Via hoge geluidsgolven -> Kan ervoor zorgen dat DNA of RNA
gaat fragmenteren
Stap 2 Isoleren
● RNA moet geïsoleerd worden uit het lysaat met de celinhoud
Stap 3 Oplossen of Concentreren
● Na het isoleren van het RNA wordt het opgelost of geconcentreerd (Zelfde
hoeveelheid RNA in een kleiner volume)
, RNA extractie met organische solventen (Trizol)
Principe: Scheiding van RNA, DNA en eiwitten op basis van hun verschillende oplosbaarheid
in verschillende niet-mengbare vloeistoffen
Grote verschil met DNA: Guanidium Thiocyanaat (Zuur) gebruiken
Guanidium Thiocyanaat is ook een RNAse inhibitor -> Handig voor RNA extractie
Stap 1: Eerst doet je Trizol Stap (Homogenisation / Lysering)
Guanidinium thiocyanaat wordt toegevoegd → Breekt de cellen open (Lyseren) en
denatureren eiwitten
Stap 2: Daarna stap van scheiding in verschillende fasen: Chloroform wordt
toegevoegd
→ Chloroform helpt bij het scheiden van DNA, RNA en eiwitten in verschillende lagen
Drie verschillende lagen:
- RNA: Organische fase
- DNA: Interfase
- Eiwitten: Waterige fase
-> Stap 3: Daarna voert men de Ethanolprecipitatie stap uit
Isopropanol wordt toegevoegd.
Die zal ervoor zorgen dat RNA onoplosbaar wordt en in de pellet terecht komt (Het zal
neerslaan)
Stap 4: RNA wassen
● Was het RNA-pellet met 70% ethanol om restanten van zouten en andere
onzuiverheden te verwijderen.
● Droog het RNA-pellet kort (om ethanol te laten verdampen).
Stap 5: RNA oplossen
● Los het RNA-pellet op in water of een speciale buffer (bijvoorbeeld RNAse-vrij
water).
