FUNDAMENTEEL EN TOEGEPAST
BIOMEDISCH EIWITONDERZOEK
80% examen + 20% flyer = punt opgeteld dient geslaagd te zien (niet apart)
This course aims to provide bachelor-level students in biomedical sciences a solid background
on the main aspects of proteins. In fact, in order to fully understand how proteins function, one
must study their three-dimensional and quaternary structures, but before one reaches this point,
proteins-of-interest must be identified, which now typically is done by means of mass
spectrometry, which also implies that at one stage, proteins must be isolated out of cells. Proteins
targeted for further structural studies are typically made recombinantly in heterologous
expression systems and must be purified prior to for instance their crystallization. The purity of
such preparations needs to be assessed, as well as the concentration of the proteins one works
with. Not only for biopharmaceuticals, but also for rather routine biochemical assays, protein
scientists very often need to alter specific side chains in proteins, and that is where the chemistry
aspect comes in. In this course, all these protein-related aspects will be introduced.
− [H2O] = 55 M
H1: EIWITCHEMIE IN HEDENDAAGS BIOMEDISCH ONDERZOEK ................................................ 2
H2: AMINOZUREN ....................................................................................................................... 5
H3: SECUNDAIRE STRUCTUURELEMENTEN EN SUPERSECUNDAIRE STRUCTUREN ................ 11
H4 : METEN EN VOORSPELLEN VAN SECUNDAIRE STRUCTUREN ............................................. 15
H5: TERTIAIRE EN QUATERNAIRE STRUCTUREN VAN PROTEÏNEN............................................. 17
H6: OPVOUWING VAN EIWITTEN............................................................................................... 34
H7: EIWIT EN PEPTIDEPURIFICATIE ........................................................................................... 40
H8: MODIFICEREN VAN AMINOZUREN ...................................................................................... 56
H9: AMINOZUUR ANALYSE ........................................................................................................ 62
H10: CHEMISCHE EN ENZYMATISCHE KLIEVING ...................................................................... 64
H11: INLEIDING TOT MASSASPECTROMETRIE........................................................................... 68
,H1: EIWITCHEMIE IN HEDENDAAGS
BIOMEDISCH ONDERZOEK
− Eiwitten = betrokken in (bijna) alle biologische/biochemische processen
= structurele eiwitten, metabolische eiwitten, antilichamen, …
− Databanken: mutaties in eiwitten en de mogelijke gevolgen
Bv. V600E2 variant van BRAF proteïne kinase ➔ constitutief actieve BRAF = melanoom
− Proteoom = volledige collectie proteïnen aanwezig in een organisme / cel(organel)
1.1 Proteïnen – transcripten – genen
Waarom eiwitonderzoek uitvoeren voor het begrijpen van biochemische processen i.v.m. ziekte?
➔ informatie proteïnen-opbouw is niet louter te vinden in het genoom – meer complex
− Proteoforms: alle biochemische en moleculaire aspecten die aanleiding geven tot
chemisch verschillende proteïnen afkomstig van eenzelfde proteïnecoderend gen
− Complexiteit van het proteoom
• Multicellulaire organismen diversifiëren het transcriptoom door alternatieve splicing
Bv. 38.000 isovormen van fruitvlieghomoloog van DSCAM
(downsyndroom celadhesiemolecule)
• (post translationele) modificaties
! kunnen heel complex zijn ➔ chemische heterogeniteit binnen de modificatie
• SNP
• Fouten tijdens translatie: alternatieve startplaatsen
• Grote variëteit binnen eiwitfamilies
Bv. bloedplasmaproteoom onderzoek met massaspectroscopie
! voornamelijk meest abundante eiwitten ‘gemeten’ – moeite met lage concentraties
2
, − Geen lineaire relatie tussen genen – transcripten – proteïnen
≠ centrale dogma: bevat heel veel controlepunten
Bv. studie op transcriptie en eiwitexpressie in kankercellijn i.v.m. normale cellijn
• Verhoogde kopijen op 1 niveau – waren niet in verband te stellen met een ander
• The butterfly effect in cancer: 1 SAP – grote up- en downregulatie van genen
− Onderzoek naar proteoom
• Genen van kleine eiwitten (< 100 AZ) hebben een grotere foutmarge
= minder vals positieven bij onderzoek naar het volledige proteoom
• Translatie initiatie codon bestuderen via ribosome profiling/footprinting
o Ribosoom bevriezen tijdens translatie
o Fractie van sequentie weghalen
o Sequeneren van deze sequentie
➔ vinden van niet-canonische AUG sites – andere start – en dus proteoforms
• Onderzoek naar signaalpeptides
= hydrofobe sequentie van aminozuren t.h.v. de N-terminus
o Niet goed te voorspellen o.b.v. AZ sequentie
➔ isolatie/karakterisatie van eiwit t.h.v. N-terminus
• Onderzoek naar ORF en stopcodon
➔ sequeneren van C-terminus op het eiwit
• Lokaliseren van proteïnen in vivo voorspellende programma’s: niet altijd accuraat
• Monitoren van PTM’s
Bv. N-glycosylatie op N – X – S/T met X ≠ P
➔ o.b.v. slechts een lineaire sequentie kan niet gegarandeerd worden dat bij
opvouwing de signaalsequentie toegankelijk is voor de modificatie
• Onderzoek naar activiteit van eiwitcomplexen: kunnen individueel wel/niet actief zijn
1.2 Proteïnen in biomedische wetenschappen
− Recombinante eiwitten
Bv. type I diabetes: recombinant geproduceerd synthetisch humaan insuline in E. coli
Bv. chronische nierziekte (CDK): synthetische EPO
− Eiwitvaccins: recombinante eiwitten of gepurifieerd uit het pathogeen organisme
• Cholera: recombinante cholera toxine B
! ook invloed op ETEC door gelijkenissen in toxines
• Diphtheria: chemisch geinactiveerd gepurifieerde toxines
• Hepatitis B: hepatitis B oppervlakte-antigenen geproduceerd in gist
• Tetanus: geinactiveerde tetanus toxines
− Biologicals = medicijnen die 1 of meerdere actieve bestanddelen, gemaakt door of
afkomstig van een biologische bron, bevat
Bv. BOTOX, nanobodies tegen von Willebrand factor = caplacizumab, …
3
, − Moleculair biomedisch onderzoek
Bv. subtiligase = variant van subtilisine protease
• Ligeert peptidebindingen i.p.v. ze te hydrolyseren
• Gebruik: identificatie/vangen van N-terminale peptiden van eiwitten en protease
substraten
1+2: substraat koppelen aan primaire alfa-amino groep van een eiwit
(substraat = peptide-ester die een biotine draagt aan de N-terminus)
3: biotine wordt ‘gevangen’ door avidine en daardoor geimmobiliseerd
4: wassen = verwijderen van niet-specifiek gebonden eiwitten en die zonder N-terminus
5: elutie van het N-terminaal peptide = activatie van het TEV protease
6: identificatie via massaspectroscopie
4
BIOMEDISCH EIWITONDERZOEK
80% examen + 20% flyer = punt opgeteld dient geslaagd te zien (niet apart)
This course aims to provide bachelor-level students in biomedical sciences a solid background
on the main aspects of proteins. In fact, in order to fully understand how proteins function, one
must study their three-dimensional and quaternary structures, but before one reaches this point,
proteins-of-interest must be identified, which now typically is done by means of mass
spectrometry, which also implies that at one stage, proteins must be isolated out of cells. Proteins
targeted for further structural studies are typically made recombinantly in heterologous
expression systems and must be purified prior to for instance their crystallization. The purity of
such preparations needs to be assessed, as well as the concentration of the proteins one works
with. Not only for biopharmaceuticals, but also for rather routine biochemical assays, protein
scientists very often need to alter specific side chains in proteins, and that is where the chemistry
aspect comes in. In this course, all these protein-related aspects will be introduced.
− [H2O] = 55 M
H1: EIWITCHEMIE IN HEDENDAAGS BIOMEDISCH ONDERZOEK ................................................ 2
H2: AMINOZUREN ....................................................................................................................... 5
H3: SECUNDAIRE STRUCTUURELEMENTEN EN SUPERSECUNDAIRE STRUCTUREN ................ 11
H4 : METEN EN VOORSPELLEN VAN SECUNDAIRE STRUCTUREN ............................................. 15
H5: TERTIAIRE EN QUATERNAIRE STRUCTUREN VAN PROTEÏNEN............................................. 17
H6: OPVOUWING VAN EIWITTEN............................................................................................... 34
H7: EIWIT EN PEPTIDEPURIFICATIE ........................................................................................... 40
H8: MODIFICEREN VAN AMINOZUREN ...................................................................................... 56
H9: AMINOZUUR ANALYSE ........................................................................................................ 62
H10: CHEMISCHE EN ENZYMATISCHE KLIEVING ...................................................................... 64
H11: INLEIDING TOT MASSASPECTROMETRIE........................................................................... 68
,H1: EIWITCHEMIE IN HEDENDAAGS
BIOMEDISCH ONDERZOEK
− Eiwitten = betrokken in (bijna) alle biologische/biochemische processen
= structurele eiwitten, metabolische eiwitten, antilichamen, …
− Databanken: mutaties in eiwitten en de mogelijke gevolgen
Bv. V600E2 variant van BRAF proteïne kinase ➔ constitutief actieve BRAF = melanoom
− Proteoom = volledige collectie proteïnen aanwezig in een organisme / cel(organel)
1.1 Proteïnen – transcripten – genen
Waarom eiwitonderzoek uitvoeren voor het begrijpen van biochemische processen i.v.m. ziekte?
➔ informatie proteïnen-opbouw is niet louter te vinden in het genoom – meer complex
− Proteoforms: alle biochemische en moleculaire aspecten die aanleiding geven tot
chemisch verschillende proteïnen afkomstig van eenzelfde proteïnecoderend gen
− Complexiteit van het proteoom
• Multicellulaire organismen diversifiëren het transcriptoom door alternatieve splicing
Bv. 38.000 isovormen van fruitvlieghomoloog van DSCAM
(downsyndroom celadhesiemolecule)
• (post translationele) modificaties
! kunnen heel complex zijn ➔ chemische heterogeniteit binnen de modificatie
• SNP
• Fouten tijdens translatie: alternatieve startplaatsen
• Grote variëteit binnen eiwitfamilies
Bv. bloedplasmaproteoom onderzoek met massaspectroscopie
! voornamelijk meest abundante eiwitten ‘gemeten’ – moeite met lage concentraties
2
, − Geen lineaire relatie tussen genen – transcripten – proteïnen
≠ centrale dogma: bevat heel veel controlepunten
Bv. studie op transcriptie en eiwitexpressie in kankercellijn i.v.m. normale cellijn
• Verhoogde kopijen op 1 niveau – waren niet in verband te stellen met een ander
• The butterfly effect in cancer: 1 SAP – grote up- en downregulatie van genen
− Onderzoek naar proteoom
• Genen van kleine eiwitten (< 100 AZ) hebben een grotere foutmarge
= minder vals positieven bij onderzoek naar het volledige proteoom
• Translatie initiatie codon bestuderen via ribosome profiling/footprinting
o Ribosoom bevriezen tijdens translatie
o Fractie van sequentie weghalen
o Sequeneren van deze sequentie
➔ vinden van niet-canonische AUG sites – andere start – en dus proteoforms
• Onderzoek naar signaalpeptides
= hydrofobe sequentie van aminozuren t.h.v. de N-terminus
o Niet goed te voorspellen o.b.v. AZ sequentie
➔ isolatie/karakterisatie van eiwit t.h.v. N-terminus
• Onderzoek naar ORF en stopcodon
➔ sequeneren van C-terminus op het eiwit
• Lokaliseren van proteïnen in vivo voorspellende programma’s: niet altijd accuraat
• Monitoren van PTM’s
Bv. N-glycosylatie op N – X – S/T met X ≠ P
➔ o.b.v. slechts een lineaire sequentie kan niet gegarandeerd worden dat bij
opvouwing de signaalsequentie toegankelijk is voor de modificatie
• Onderzoek naar activiteit van eiwitcomplexen: kunnen individueel wel/niet actief zijn
1.2 Proteïnen in biomedische wetenschappen
− Recombinante eiwitten
Bv. type I diabetes: recombinant geproduceerd synthetisch humaan insuline in E. coli
Bv. chronische nierziekte (CDK): synthetische EPO
− Eiwitvaccins: recombinante eiwitten of gepurifieerd uit het pathogeen organisme
• Cholera: recombinante cholera toxine B
! ook invloed op ETEC door gelijkenissen in toxines
• Diphtheria: chemisch geinactiveerd gepurifieerde toxines
• Hepatitis B: hepatitis B oppervlakte-antigenen geproduceerd in gist
• Tetanus: geinactiveerde tetanus toxines
− Biologicals = medicijnen die 1 of meerdere actieve bestanddelen, gemaakt door of
afkomstig van een biologische bron, bevat
Bv. BOTOX, nanobodies tegen von Willebrand factor = caplacizumab, …
3
, − Moleculair biomedisch onderzoek
Bv. subtiligase = variant van subtilisine protease
• Ligeert peptidebindingen i.p.v. ze te hydrolyseren
• Gebruik: identificatie/vangen van N-terminale peptiden van eiwitten en protease
substraten
1+2: substraat koppelen aan primaire alfa-amino groep van een eiwit
(substraat = peptide-ester die een biotine draagt aan de N-terminus)
3: biotine wordt ‘gevangen’ door avidine en daardoor geimmobiliseerd
4: wassen = verwijderen van niet-specifiek gebonden eiwitten en die zonder N-terminus
5: elutie van het N-terminaal peptide = activatie van het TEV protease
6: identificatie via massaspectroscopie
4
