CEL II
CYTOLOGIE
HOOFDSTUK 1: prepareren en observeren van cellen en weefsels
Doel = cellen en weefsels zichtbaar maken voor licht/ elektronen microscoop
Methodes = fixeren, inbedden of snijden, kleuren of contrasteren
Studie celcultivering
Cel behandeld met enzymen -> komen los uit weefsel -> in schaaltje (primaire
cultuur) -> velen sterven, sommigen veranderen -> stabiele cultuur -> schaaltje
vol -> terug scheiden (secundaire cultuur)
Celculturen: monolaagcultuur, kolonies (hoopjes)
MEM (minimum essential medium)
- Isotonische zouten - energiebron (glucose)
- Essentiele aminozuren en vitamines - serum
Onder atmosfeer van 5% CO2 (vergelijkbaar met bloed en weefselvocht) -
> bereiken pH 7,4
Cultuurrecipiënten: open platen (in CO2 oven), rollerflessen (groot oppervlak),
CO2oven met cultuurplaten, gesloten flessen (falcons) -> CO2 toevoegen voor
dichtdraaien
Afkomst cellen: laboratoria, eigen isolatie (primaire culturen) of celbanken (bv
ATTC)
Groeisubstraat = fysische drager -> beschermt tegen anoïkis
(geprogrammeerde celdood)
Essentieel voor adherente celculturen
Doel = in vitro zelfde condities creeren dan in vivo
Cellen op eiwit ECM laten groeien (extra-cellulaire matrix)
Medium v moedercultuur gebruiken
Op feeder cellaag laten groeien
Doel
1) Aspecifieke fysische interactie: toelaten v cellulaire adhesie en celspreiding
2) Specifieke functionele interactie met onderliggende cellen en ECM ->
differentiatie-inductie door stimulatie vanwege de basale membraan
Cellen delen tot confluente 2D-monolayer -> contactinhibitie v celproliferatie
(celdeling) door concurrentie voor mitogenen
Splitsen in dochterculturen of vers medium toevoegen
Tumorcellen kunnen ook in 3D splitsen = vermogen v
contactinhibitie verloren
Celtransfer
1) Verdunning v suspensiecultures
,Bij adherente cellen: transfer als confluentie vd cellaag optreedt
2) Behandeld met trypsine/EDTA:
- Trypsine: breekt eiwitten af die elkaar bijeenhouden
- EDTA: verbreekt intercellulaire adhesie en cel-substraat-binding
3) Gesplitst in verhouden bv 1/3: 1/3e naar dochtercultuur
4) Trypsine geinhibeerd door protease-inhibitoren in serum
,Celadhesie en -spreiding
1) Cellen zakken door gravitatie
2) Maken initieel contact met substraat (cellen nog opgebold -> minimale
adhesie)
3) Progressieve spreiding over substraat (kost energie en cytoskelet-
wijzigingen) -> vergroten celcontactoppervlakte + versterking cel-
substraatadhesie
4) Sterke binding met substraat (wijzigen het met eigen ECM moleculen)
Ondanks sterke adhesie kan cel migreren over contactopp
STAMCEL: cel met het vermogen om zich voortdurend te delen en differentiëren
in verschillende andere soorten cellen/weefsels
Eigenschappen: vermogen tot zelfvernieuwing (delen zichzelf en kopieen
maken) + tot differentiatie
- Totipotent: potentie om tot volledige foetus te ontwikkelen
(bv 2 cellen na de bevruchting, 140 cellen v blastocyst)
- Pluripotent: potentie om zich te ontwikkelen tot veel, maar niet alle celtypes
(geen foetus)
(bv cellen van binnenste celmassa blastocyst)
- Multipotent: potentie tot ontwikkeling versch (beperkt) soorten
gespecialiseerde cellen
Aanmaak humane embryonale stamcellen
Cellen uit morulastadium van embryo uit IVF -> in cultuur brengen -> kan geen
volledig individu gevormd worden
Ethisch meer oke: cel isoleren (eender welke cel maar volledig gedifferentieerd) -
> in cultuur -> pluripotente stamcellen maken met mix v eiwitten
Doel = nieuw materiaal uit eigen cellen
Contaminatie met micro-organismen
- Probleem: hun snelle groei + antibioticaresistente mycoplasma’s (=parasitair)
Moeilijk detecteerbaar en elimineerbaar
Contaminatie met vreemde cellen
Bv HeLa lijn (= afgeleid v humane cervix-tumor)
Cellen en weefsels microscopisch bestuderen
Fixeren:
Weefsel uit in vivo -> afbraakenzymen activeren -> degradatie vh weefsel ->
weefsels bewaren met behoud v oorspronkelijke structuur? -> denatureren v
afbraakeiwitten
- Door invriezen - door chemische fixatiemiddelen
ARTEFACTEN: veranderingen die tijdens fixatie in weefsel ontstaan en afwijken
van in vivo situatie
Inbedden:
Hard maken om coupes te krijgen waar lichtstralen of elektronen doorkunnen
, - Inbedmiddelen: hydrofoob -> dringt in weefsel (bevat veel water) ->
ontwateren met alcohol -> tolueen die kan mengen met alcohol en
inbedmiddel
Bv parafinne, hars, plastic
Snijden:
Paraffine: vrij zacht -> coupes met min dikte 5-10microm voor LM
Harsen en plastics: harder -> coupes tot 60-70nm voor EM
Lichtmicroscopie:
- Resolutie bepaald door objectief en golflengte
RESOLUTIE: kleinste afstand tussen 2 punten waarmee de punten nog net
weergeven worden
- Effectieve resolutie bepaald door natuur v preparaat
Gefixeerd & gekleurd -> detectie op basis v lichtabsorptie (klaarveldmicroscopie)
Levend met weinig contrast -> speciale microscopische technieken
Klassieke licht- of klaarveldmicroscoop zie dia 52-54
3 lenssystemen: condensor, objectief en oculairen
- Condensor: bundelt doorvallend licht op preparaat
Belichting en objectief bepalen: lichtsterkte, resolutie en kwaliteit beeld
Licht valt in -> door spiegel in condensator op preparaat gebundeld -> objectief
vormt vergroot beeld -> door oculair navergroot -> op retina geprojecteerd
(prisma buigt het licht)
LM analyse met kleuring
- PAS: kleurt vrije suikers
- Hematoxyline: kleurt zure componenten (bv nucleinezuren) donkerblauw
- Eosine: kleurt acidofiele stoffen (NH2-groepen v eiwitten) roze
Speciale LM
1) Fasecontrastmicroscopie: berust op bewerken v kleine
faseveranderingen door kleine brekingsverschillen in preparaat
Niet-gekleurde cel, maar binnen cel verschillen in optische dichtheid ->
afwijkende brekingsindex
Herleid tot zwart-wit beeld -> verschillen worden vergroot op
fasecontrastringen
2) Differentieel interfentie-contrastmicroscopie: berust op verschillen in
interferentie v gepolariseerd licht
3) Digitale microscopie: dynamisch
4) Fluorescentiemicroscopen
Epifluorescentie: fluochroom (fluorescerende kleurstof) aangebracht ->
excitatielicht met korte golflengte -> aangeslagen toestand -> emissie van licht
langere golflengte
- Ion-gevoelige kleurstoffen: fluorescentie afhankelijk v concentratie ionen
CYTOLOGIE
HOOFDSTUK 1: prepareren en observeren van cellen en weefsels
Doel = cellen en weefsels zichtbaar maken voor licht/ elektronen microscoop
Methodes = fixeren, inbedden of snijden, kleuren of contrasteren
Studie celcultivering
Cel behandeld met enzymen -> komen los uit weefsel -> in schaaltje (primaire
cultuur) -> velen sterven, sommigen veranderen -> stabiele cultuur -> schaaltje
vol -> terug scheiden (secundaire cultuur)
Celculturen: monolaagcultuur, kolonies (hoopjes)
MEM (minimum essential medium)
- Isotonische zouten - energiebron (glucose)
- Essentiele aminozuren en vitamines - serum
Onder atmosfeer van 5% CO2 (vergelijkbaar met bloed en weefselvocht) -
> bereiken pH 7,4
Cultuurrecipiënten: open platen (in CO2 oven), rollerflessen (groot oppervlak),
CO2oven met cultuurplaten, gesloten flessen (falcons) -> CO2 toevoegen voor
dichtdraaien
Afkomst cellen: laboratoria, eigen isolatie (primaire culturen) of celbanken (bv
ATTC)
Groeisubstraat = fysische drager -> beschermt tegen anoïkis
(geprogrammeerde celdood)
Essentieel voor adherente celculturen
Doel = in vitro zelfde condities creeren dan in vivo
Cellen op eiwit ECM laten groeien (extra-cellulaire matrix)
Medium v moedercultuur gebruiken
Op feeder cellaag laten groeien
Doel
1) Aspecifieke fysische interactie: toelaten v cellulaire adhesie en celspreiding
2) Specifieke functionele interactie met onderliggende cellen en ECM ->
differentiatie-inductie door stimulatie vanwege de basale membraan
Cellen delen tot confluente 2D-monolayer -> contactinhibitie v celproliferatie
(celdeling) door concurrentie voor mitogenen
Splitsen in dochterculturen of vers medium toevoegen
Tumorcellen kunnen ook in 3D splitsen = vermogen v
contactinhibitie verloren
Celtransfer
1) Verdunning v suspensiecultures
,Bij adherente cellen: transfer als confluentie vd cellaag optreedt
2) Behandeld met trypsine/EDTA:
- Trypsine: breekt eiwitten af die elkaar bijeenhouden
- EDTA: verbreekt intercellulaire adhesie en cel-substraat-binding
3) Gesplitst in verhouden bv 1/3: 1/3e naar dochtercultuur
4) Trypsine geinhibeerd door protease-inhibitoren in serum
,Celadhesie en -spreiding
1) Cellen zakken door gravitatie
2) Maken initieel contact met substraat (cellen nog opgebold -> minimale
adhesie)
3) Progressieve spreiding over substraat (kost energie en cytoskelet-
wijzigingen) -> vergroten celcontactoppervlakte + versterking cel-
substraatadhesie
4) Sterke binding met substraat (wijzigen het met eigen ECM moleculen)
Ondanks sterke adhesie kan cel migreren over contactopp
STAMCEL: cel met het vermogen om zich voortdurend te delen en differentiëren
in verschillende andere soorten cellen/weefsels
Eigenschappen: vermogen tot zelfvernieuwing (delen zichzelf en kopieen
maken) + tot differentiatie
- Totipotent: potentie om tot volledige foetus te ontwikkelen
(bv 2 cellen na de bevruchting, 140 cellen v blastocyst)
- Pluripotent: potentie om zich te ontwikkelen tot veel, maar niet alle celtypes
(geen foetus)
(bv cellen van binnenste celmassa blastocyst)
- Multipotent: potentie tot ontwikkeling versch (beperkt) soorten
gespecialiseerde cellen
Aanmaak humane embryonale stamcellen
Cellen uit morulastadium van embryo uit IVF -> in cultuur brengen -> kan geen
volledig individu gevormd worden
Ethisch meer oke: cel isoleren (eender welke cel maar volledig gedifferentieerd) -
> in cultuur -> pluripotente stamcellen maken met mix v eiwitten
Doel = nieuw materiaal uit eigen cellen
Contaminatie met micro-organismen
- Probleem: hun snelle groei + antibioticaresistente mycoplasma’s (=parasitair)
Moeilijk detecteerbaar en elimineerbaar
Contaminatie met vreemde cellen
Bv HeLa lijn (= afgeleid v humane cervix-tumor)
Cellen en weefsels microscopisch bestuderen
Fixeren:
Weefsel uit in vivo -> afbraakenzymen activeren -> degradatie vh weefsel ->
weefsels bewaren met behoud v oorspronkelijke structuur? -> denatureren v
afbraakeiwitten
- Door invriezen - door chemische fixatiemiddelen
ARTEFACTEN: veranderingen die tijdens fixatie in weefsel ontstaan en afwijken
van in vivo situatie
Inbedden:
Hard maken om coupes te krijgen waar lichtstralen of elektronen doorkunnen
, - Inbedmiddelen: hydrofoob -> dringt in weefsel (bevat veel water) ->
ontwateren met alcohol -> tolueen die kan mengen met alcohol en
inbedmiddel
Bv parafinne, hars, plastic
Snijden:
Paraffine: vrij zacht -> coupes met min dikte 5-10microm voor LM
Harsen en plastics: harder -> coupes tot 60-70nm voor EM
Lichtmicroscopie:
- Resolutie bepaald door objectief en golflengte
RESOLUTIE: kleinste afstand tussen 2 punten waarmee de punten nog net
weergeven worden
- Effectieve resolutie bepaald door natuur v preparaat
Gefixeerd & gekleurd -> detectie op basis v lichtabsorptie (klaarveldmicroscopie)
Levend met weinig contrast -> speciale microscopische technieken
Klassieke licht- of klaarveldmicroscoop zie dia 52-54
3 lenssystemen: condensor, objectief en oculairen
- Condensor: bundelt doorvallend licht op preparaat
Belichting en objectief bepalen: lichtsterkte, resolutie en kwaliteit beeld
Licht valt in -> door spiegel in condensator op preparaat gebundeld -> objectief
vormt vergroot beeld -> door oculair navergroot -> op retina geprojecteerd
(prisma buigt het licht)
LM analyse met kleuring
- PAS: kleurt vrije suikers
- Hematoxyline: kleurt zure componenten (bv nucleinezuren) donkerblauw
- Eosine: kleurt acidofiele stoffen (NH2-groepen v eiwitten) roze
Speciale LM
1) Fasecontrastmicroscopie: berust op bewerken v kleine
faseveranderingen door kleine brekingsverschillen in preparaat
Niet-gekleurde cel, maar binnen cel verschillen in optische dichtheid ->
afwijkende brekingsindex
Herleid tot zwart-wit beeld -> verschillen worden vergroot op
fasecontrastringen
2) Differentieel interfentie-contrastmicroscopie: berust op verschillen in
interferentie v gepolariseerd licht
3) Digitale microscopie: dynamisch
4) Fluorescentiemicroscopen
Epifluorescentie: fluochroom (fluorescerende kleurstof) aangebracht ->
excitatielicht met korte golflengte -> aangeslagen toestand -> emissie van licht
langere golflengte
- Ion-gevoelige kleurstoffen: fluorescentie afhankelijk v concentratie ionen
