Hoofdstuk 3: RNA
Inleiding
DNA vs RNA
DNA RNA
Thymine (stabieler) Uracil
Deoxyribose (geen 2’OH) Ribose (wel 2’OH) —> vatbaar voor
afbraak door RNAsen
Stabiel Makkelijker modi caties
Ds Ss
Kan secundaire/ tertiaire structuur
hebben
ddNTPs bij Sanger sequencing => ook
geen 3’OH => geen ketenverlenging
(fosfodiesterbinding))
Soorten RNA
tRNA => TLN naar eiwitten
mRNA = boodschap voor TLN
rRNA (95%) => veel aanwezig DUS voor
kwaliteitscontrole
lncRNA = lang (>200 nt)
siRNA = kort => moduleren cellen
miRNA = kort (<200 nt) => reguleren TXN (genexpressie)
Niet coderend RNA
mRNA
DNA —> pre-mRNA —> mRNA (matuur) —>
polypeptide
Splicing = verwijderen
• Pre-MRNA (tijdelijk) = 5’cap + exonen +
intrionen + polyAstaart
• mRNA: 5’cap + 5’UTR + 3’UTR + polyA
=> niet naar eiwit
5’cap en polyA niet gecodeerd maar post-transcriptie toegevoegd
1
,Voorzorgen en bewaren voor problemen
Modi catie RNA in staal (RNA instabiel <>DNA)
= Degradatie (dmv endogene/exogene bv.RNAse) + inductie genen
Anticoagulans EDTA bij staalname <> heparine (inhibeert RNA reactie)
RNA stabilisatie => langer bewaren
• snel werken, inviezen (vloeib. N2),
• RNA bewaarmiddel => langer bewaren bij Tkamer
—> bij
bloed (bv.PAXgene tube)/ bij cellen bv. Trizol (1e stap extractie) of RNAlater
(voor extractie): (NH₄)₂SO₄ -opl. => neerslag eiwitten (RNAse = eiwit)
RNAse vrij werk
labojas, handschoenen, RNAse schoonmaakproduct, buffer/water bewerken met RNAse
inhibitor => nuclease-vrij
bv. DEPC (carcinogeen): reactie amines van AZ in katalytic site(!niet in Trisbuffer:
Tris= amine)
Bewaring RNA
• In RNAse vrij water/ TE buffer (EDTA inhib. enkel DNAsen), op -80°C (1jaar
<DNA), als alcoholprecipitaat,, meerdere aliquots in RNA bewaarmiddel => later
RNA extractie
DNA contaminatie bij RNA extractie
(!moeilijker DNA verwijderen van RNA dan RNA van DNA)
• Niet altijd probleem
• Detectie via electroforese of RTmin controle
• DNAse behandeling ALS contaminatie WANT ook verlies/degradatie RNA
= DNAse(I) tijdens/na extractie RNA => knip DNA + hitte inactivatie/ verwijderen
DNAse
2
,RNA extractie
! vgl met DNA extractie
Lysis van staal = kapot maken cellen
= breken cellen (RNA vrij) => lysaat/ homogenaat = vl. met inhoud cellen (afh.
startmateriaal en doel)
Vaak toevoeging remmers van niet-gewenste moleculen, bv DNasen, RNAasen,
proteasen,…
Methoden voor lysisch (afh. weefsel, celtype, V, …):
• Detergent toev. (meestal) bv. SDS, Trizol (guanidium thiocyanaat), guanidium
chloride..=> lysis
• Vriezen en ontdooien (snel) => lyseren (kapot maken) cellen
( <> cryopreservatie (=traag) om cellen intact/leefbaar te houden)
• Mechanische homogenisatie:
• stikstof
• Bead-gebaseerde homogenisator: beads (= kralen) in buis met cellen +
schudden => homogenaat
• Vloeibare homogenisatie: dounce homogenisator/ douncer: oplossing tussen
glazen pestels => bewegen => vloeistofstroom => lyseren cellen
• Positief: milder: organellen intact (<> mechanische)
• Sonicatie (geluidsgolven) => OOK DNA/ RNA fragmenteren (bv. bij Sanger: DNA
frag nodig)
3
, Isoleren/extractie RNA
= RNA uit lysaat opzuiveren (geen eiwitten, DNA,…) dmv
organisch solvent, alcoholprecipitatie of
kolomchromatogra e
Organisch solvent = Trizol = “in huis” protocol
= guanidium thiocyanaat (zuur: pH 4) – fenol – chloroform
—> detergent => cel lysis + RNAse inhibitor (=> RNA intact)
Werking:
• organische- + inter- + waterlaag met RNA (boven) => overbrengen H20 laag tube
=> alcoholprecipitatie/ kolomchromatogra e => isolatie RNA
• makkelijk, goedkoop, goede oprengst
Vergelijk DNA:
fenol – chloroform voor extractie DNA (pH=7 <> Trizol = zuur) RNA (negatief Q:
polair) altijd in H20 laag <> DNA in H20 of organische/ interlaag afh. van pH
(negatief Q/neutr.)
Alcoholprecipitatie supernatans (precipitatie = neerslag)
= idem DNA
DNA & RNA (P0 -) neerslag bij toevoegen zout (bv Na+, Na-acetaat) + alcohol
(ethanol, isopropanol)
=> Neg. DNA neutr. door Na+ (=hydrofoob)+ alcohol => neerslag uit opl. => vlokje
(bij lage conc.: lagere temp. Of drager (glycogeen) toev. => beter zichtbaar)
=> RNA/DNA pellet oplossen in water/buffer
1e organisch/kolom => DNA/RNA dan precipitatie => neerslag DNA/RNA
—> DNA extractie: RNAsen toev => enkel DNA
—> RNA extractie (moeilijker) : 1e test of contaminatie DNA, 2e DNAsen (want RNA
verlies)
Kolomchromatogra e
1e RNA (/DNA) bindt selectief silica kolom dmv zout + pH condities => rest loopt
door (!DNA niet 100%)
2e Elutie RNA door … condities
Opstelling:
lysaat in kolom (silica/anionenuitwiss.) => vloeistof door kolom (dmv centrif., Fz of
vacuüm)
Positieve eigenschappen
• eenvoudig, zeer goede zuiverheid
4
Inleiding
DNA vs RNA
DNA RNA
Thymine (stabieler) Uracil
Deoxyribose (geen 2’OH) Ribose (wel 2’OH) —> vatbaar voor
afbraak door RNAsen
Stabiel Makkelijker modi caties
Ds Ss
Kan secundaire/ tertiaire structuur
hebben
ddNTPs bij Sanger sequencing => ook
geen 3’OH => geen ketenverlenging
(fosfodiesterbinding))
Soorten RNA
tRNA => TLN naar eiwitten
mRNA = boodschap voor TLN
rRNA (95%) => veel aanwezig DUS voor
kwaliteitscontrole
lncRNA = lang (>200 nt)
siRNA = kort => moduleren cellen
miRNA = kort (<200 nt) => reguleren TXN (genexpressie)
Niet coderend RNA
mRNA
DNA —> pre-mRNA —> mRNA (matuur) —>
polypeptide
Splicing = verwijderen
• Pre-MRNA (tijdelijk) = 5’cap + exonen +
intrionen + polyAstaart
• mRNA: 5’cap + 5’UTR + 3’UTR + polyA
=> niet naar eiwit
5’cap en polyA niet gecodeerd maar post-transcriptie toegevoegd
1
,Voorzorgen en bewaren voor problemen
Modi catie RNA in staal (RNA instabiel <>DNA)
= Degradatie (dmv endogene/exogene bv.RNAse) + inductie genen
Anticoagulans EDTA bij staalname <> heparine (inhibeert RNA reactie)
RNA stabilisatie => langer bewaren
• snel werken, inviezen (vloeib. N2),
• RNA bewaarmiddel => langer bewaren bij Tkamer
—> bij
bloed (bv.PAXgene tube)/ bij cellen bv. Trizol (1e stap extractie) of RNAlater
(voor extractie): (NH₄)₂SO₄ -opl. => neerslag eiwitten (RNAse = eiwit)
RNAse vrij werk
labojas, handschoenen, RNAse schoonmaakproduct, buffer/water bewerken met RNAse
inhibitor => nuclease-vrij
bv. DEPC (carcinogeen): reactie amines van AZ in katalytic site(!niet in Trisbuffer:
Tris= amine)
Bewaring RNA
• In RNAse vrij water/ TE buffer (EDTA inhib. enkel DNAsen), op -80°C (1jaar
<DNA), als alcoholprecipitaat,, meerdere aliquots in RNA bewaarmiddel => later
RNA extractie
DNA contaminatie bij RNA extractie
(!moeilijker DNA verwijderen van RNA dan RNA van DNA)
• Niet altijd probleem
• Detectie via electroforese of RTmin controle
• DNAse behandeling ALS contaminatie WANT ook verlies/degradatie RNA
= DNAse(I) tijdens/na extractie RNA => knip DNA + hitte inactivatie/ verwijderen
DNAse
2
,RNA extractie
! vgl met DNA extractie
Lysis van staal = kapot maken cellen
= breken cellen (RNA vrij) => lysaat/ homogenaat = vl. met inhoud cellen (afh.
startmateriaal en doel)
Vaak toevoeging remmers van niet-gewenste moleculen, bv DNasen, RNAasen,
proteasen,…
Methoden voor lysisch (afh. weefsel, celtype, V, …):
• Detergent toev. (meestal) bv. SDS, Trizol (guanidium thiocyanaat), guanidium
chloride..=> lysis
• Vriezen en ontdooien (snel) => lyseren (kapot maken) cellen
( <> cryopreservatie (=traag) om cellen intact/leefbaar te houden)
• Mechanische homogenisatie:
• stikstof
• Bead-gebaseerde homogenisator: beads (= kralen) in buis met cellen +
schudden => homogenaat
• Vloeibare homogenisatie: dounce homogenisator/ douncer: oplossing tussen
glazen pestels => bewegen => vloeistofstroom => lyseren cellen
• Positief: milder: organellen intact (<> mechanische)
• Sonicatie (geluidsgolven) => OOK DNA/ RNA fragmenteren (bv. bij Sanger: DNA
frag nodig)
3
, Isoleren/extractie RNA
= RNA uit lysaat opzuiveren (geen eiwitten, DNA,…) dmv
organisch solvent, alcoholprecipitatie of
kolomchromatogra e
Organisch solvent = Trizol = “in huis” protocol
= guanidium thiocyanaat (zuur: pH 4) – fenol – chloroform
—> detergent => cel lysis + RNAse inhibitor (=> RNA intact)
Werking:
• organische- + inter- + waterlaag met RNA (boven) => overbrengen H20 laag tube
=> alcoholprecipitatie/ kolomchromatogra e => isolatie RNA
• makkelijk, goedkoop, goede oprengst
Vergelijk DNA:
fenol – chloroform voor extractie DNA (pH=7 <> Trizol = zuur) RNA (negatief Q:
polair) altijd in H20 laag <> DNA in H20 of organische/ interlaag afh. van pH
(negatief Q/neutr.)
Alcoholprecipitatie supernatans (precipitatie = neerslag)
= idem DNA
DNA & RNA (P0 -) neerslag bij toevoegen zout (bv Na+, Na-acetaat) + alcohol
(ethanol, isopropanol)
=> Neg. DNA neutr. door Na+ (=hydrofoob)+ alcohol => neerslag uit opl. => vlokje
(bij lage conc.: lagere temp. Of drager (glycogeen) toev. => beter zichtbaar)
=> RNA/DNA pellet oplossen in water/buffer
1e organisch/kolom => DNA/RNA dan precipitatie => neerslag DNA/RNA
—> DNA extractie: RNAsen toev => enkel DNA
—> RNA extractie (moeilijker) : 1e test of contaminatie DNA, 2e DNAsen (want RNA
verlies)
Kolomchromatogra e
1e RNA (/DNA) bindt selectief silica kolom dmv zout + pH condities => rest loopt
door (!DNA niet 100%)
2e Elutie RNA door … condities
Opstelling:
lysaat in kolom (silica/anionenuitwiss.) => vloeistof door kolom (dmv centrif., Fz of
vacuüm)
Positieve eigenschappen
• eenvoudig, zeer goede zuiverheid
4
