BIOTECHNOLOGIE
INHOUDSOPGAVE
1. inleiding ...........................................................................................................................................................................3
2. genetisch materiaal .........................................................................................................................................................5
2.1 structuur dna ..................................................................................................................................................................5
2.1.1 elementen van de dna-molecule ..........................................................................................................................5
2.1.2 verschil genetisch materiaal van prokaryoten ......................................................................................................6
2.2 dna replicatie ..................................................................................................................................................................7
2.3 eiwitsynthese ..................................................................................................................................................................9
2.3.1 dna transcriptie...................................................................................................................................................10
2.3.2 enzymen en nucleïnezuren .................................................................................................................................16
2.3.3 translatie .............................................................................................................................................................20
2.4 extrachromosomaal DNA .............................................................................................................................................27
2.4.1 mitochondriaal en (chloro)plasten dna ..............................................................................................................27
2.4.2 plasmiden ...........................................................................................................................................................28
2.5 expressie van genen .....................................................................................................................................................28
2.5.1 chromosoom niveau ...........................................................................................................................................29
2.5.2 transcriptie niveau ..............................................................................................................................................30
2.5.3 RNA-processing niveau .......................................................................................................................................31
2.5.4 translatie niveau .................................................................................................................................................32
2.5.5 proteïneprocessing en degradatie niveau ..........................................................................................................33
3. veranderingen in genetisch materiaal ............................................................................................................................34
3.1 veranderingen in de genen ...........................................................................................................................................35
3.2 veranderingen in chromosomen ...................................................................................................................................37
4. biotechnologische technieken .......................................................................................................................................38
4.1 PCR (polymerase chain reaction ...................................................................................................................................38
4.1.1 principe ...............................................................................................................................................................38
4.1.2 evaluatie van de pcr-producten ..........................................................................................................................41
4.1.3 amplificeren van RNA (rt-pcr) .............................................................................................................................42
4.1.4 kwantitatieve PCR (qpcr) ....................................................................................................................................43
4.1.5 andere pcr technieken zijn .................................................................................................................................49
4.1.6 toepassingen .......................................................................................................................................................50
4.2 dna sequentie-analyse..................................................................................................................................................50
4.2.1 eerste generatie sequentieanalyse .....................................................................................................................50
4.2.2 tweede generatie sequencing (next generation sequencing) ............................................................................52
4.2.3 derde generatie sequencing (dna aflezen door een nanogaatje) .......................................................................57
4.2.4 toepassingen .......................................................................................................................................................59
4.3 genetisch profiel, dna fingerprinting ............................................................................................................................60
4.3.1 rflp fingerprinting................................................................................................................................................61
4.3.2 rapd (random amplified polymorphic DNA) .......................................................................................................62
4.3.3 aflp (amplified fragment length polymophism) ..................................................................................................63
4.4 eiwit-onderzoek ............................................................................................................................................................65
4.4.1 samenstellende aminozuren ..............................................................................................................................65
1
, 4.4.2 immunoblotting – western blotting....................................................................................................................65
4.4.3 elisa .....................................................................................................................................................................68
4.4.4 snelle antigeen test .............................................................................................................................................71
4.5 recombinant dna technologie ......................................................................................................................................72
4.5.1 ti-plasmide ..........................................................................................................................................................75
4.5.2 rna interferentie (irna of rnai) ............................................................................................................................77
4.5.3 crispr cas .............................................................................................................................................................79
2
, 1. INLEIDING
− Technologie gebaseerd op biologie
− Maakt gebruik van dieren, planten, bacteriën of andere levende wezens voor ontwikkeling van
medicijnen, voedsel of nieuwe stoffen → biologische kennis gebruiken om iets nuttig te doen
− Klassieke biotechnologie: vooral begaan met traditionele technieken om dieren en planten te
kweken + het gebruik van bacteriën, gisten en schimmels voor de productie van brood, bier, wijn en
kaas
− Moderne biotechnologie: duwt voorgaande technieken een eind verder → past eigenschappen van
bacteriën, planten en dieren aan door rechtstreeks in te grijpen op DNA (code van alle erfelijke
informatie)
o Onnoemelijk kleine structuur die alle informatie bevat om een volledig organisme op te
bouwen en correct te laten functioneren
Geneeskunde
− Meer dan 250 biotechnologische geneesmiddelen en vaccins beschikbaar
− Veel gericht op ziektes die vroeger onbehandelbaar waren
= rode biotechnologie
− Vb. insuline: vroeger uit pancreas van geslachte varkens (verschilt van menselijke insuline), nu:
menselijke insuline geproduceerd door bacteriën en gisten (GGO’s die een onuitputtelijke voorraad
insuline bieden)
Landbouw
− Opbrengst landbouwgewassen te verhogen, schade door insecten en ongedierte te voorkomen en
impact landbouw op milieu te verminderen
= groene biotechnologie
− Vb. Bt-mais en-katoen → beschermd tegen insectenvraat
Voeding
− Belangrijke rol bij productie van veel voedingsmiddelen
− Belangrijkste toepassingen: levensmiddelenindustrie → bakken van brood en produceren van
fruitsap
= witte biotechnologie
− Vb. zuivelindustrie: chymosine voor kaasproductie om melk te stremmen (oorspronkelijk uit
lebmagen van kalveren, maar is schaars en duur) → genetisch gewijzigde gistcellen produceren nu
zuiver chymosine
Industrie
− Ingezet om productieprocessen sneller en duurzamer te laten verlopen
3
, − Enzymen, bacteriën en schimmels: omgebouwd tot mini-fabriekjes → helpen bij tal van
toepassingen
= witte biotechnologie
− Vb. werking waspoeders verbeteren: specifieke enzymen toegevoegd; gros wordt aangemaakt
door genetisch gewijzigde bacteriën, schimmels en gisten; enzymen nemen deel functie zeep over
op een efficiënte manier → wasgoed is sneller proper en kan bij lagere temperatuur gewassen
worden met minder water
− Vb. papier bleken: vroeger met chemische middelen zoals chloor, nu kan dat op natuurlijke
manieren laccase is verantwoordelijk voor abraak moleculen die zorgen voor de bruine kleur van
papierpulp → laccase ingebouwd in DNA van gisten → gisten worden gebruikt om chloorvrij
papier te bleken
− Vb. leerlooien
Wetenschappelijk onderzoek
− Wetenschappers gebruiken technieken van biotechnologie om inzicht te verwerven in hoe het
leven in elkaar zit; tot fijnste detail
− Gebruik van bacteriën, schimmels en proefdieren
− Deze kennis levert inzicht in waarom de ene mens ziek wordt en de andere niet, leer ons hoe
planten groeien, hoe we gisteren kunen aanpassen
− Deze kennis kan verder toegepast worden in geneeskunde, landbouw, voeding en industrie
4
,2. GENETISCH MATERIAAL
− Genen moesten opgebouwd zijn uit moleculen; pas tegen eind 19 e eeuw werd duidelijk dat
overerfbare eigenschappen zich bevonden op chromosomen, deze structuren werden duidelijk bij
het delen van de kern
− Elke cel bevat genetisch materiaal = DNA = desoxyribonucleïnezuur
− Elke cel: 46 chromosomen → dragers van erfelijk materiaal (opgebouwd uit genen die coderen voor
eiwitten
o Elk eiwitproduct vervult een specifieke functie → eiwitten bepalen samen de kenmerken
van elke levende cel
− DNA beïnvloedt het uitzicht en functioneren van een cel en van het organisme dat uit die cellen is
opgebouwd
o Deze informatie wordt doorgegeven aan dochtercellen bij
gewone celdeling en aan de nakomelingen bij een
geslachtelijke voortplanting: DNA is de drager van erfelijke
informatie
2.1 STRUCTUUR DNA
2.1.1 ELEMENTEN VAN DE DNA-MOLECULE
− DNA = desoxyribonucleïnezuur → 2 complementaire strengen die schroefvormig rond elkaar
gewonden zijn tot dubbele helix-structuur
o Streng = aaneenschakeling van nucleotiden
• Bestaan uit een pentosesuiker (desoxyribose)
o Op de 2e koolstof een H (desoxy) bij het RNA is
dit een hydroxylgroep (OH) dus geen
voorvoegsel desoxy
• Een fosfaatgroep
• Ene purine of pyrimidinebase
o Niet verrassend want een helix-structuur is veelvoorkomend bij polymeren met herhalende
eenheden; volgt uit het feit dat op deze manier de eenheden ruimtelijk het verst uit elkaar
geplaatst kunnen worden
− Wel verrassend: een dubbele helix met alle basen aan de binnenzijde en suikerfosfaten aan de
buitenzijde
o De oriëntatie van de basen aan de binnenzijde liet uitschijnen dat de basen van de ene streng
zeer dicht tegen de andere moesten liggen → kon enkel mogelijk zijn als er paren gevormd
werden tussen een grote purine base (A of G met een dubbel ring) op de ene streng en een
kleinere pyrimidene base (T of G met een enkele ring)
o Grote purine basen:
▪ Adenine en guanine
o Kleinere pyrimidinebasen:
5
, ▪ Cytosine en thymine (uracyl bij RNA)
o Binding tussen purine en pyrimidine: waterstofbindingen; bij moleculaire opbouw =
complementaire basenparen gevormd (complementariteit)
− Opbouw gebeurt door toevoegen van desoxyribonucleosidetrifosfaat
o Deze trifosfaatgroep is gebonden aan 5e koolstofatoom van de suikergroep = 5’ en deze zal
2 fosfaatgroepen afsplitsen (= pyrofosfaat) en zich hechten aan het 3e koolstofatoom = 3’
van de laatste nucleotide van de DNA-streng
o Gevolg: DNA-streng zal altijd beginnen met een vrije fosfaatgroep op de eerste 5’ en zal
steeds aangroeien in de 3’ richting (altijd van 5’ naar 3’)
− Dubbele helix DNA kan men voorstellen als een touwladder die om de lengteas gedraaid is waarbij
de zijkanten door fosfaat-suikerbinding gevormd worden
o ‘sporten’ van de lader zijn de complementaire baseparen
− De complementaire strengen in de dubbele DN-helix zijn antiparallel opgebouwd: ene streng loopt
van 3’ naar 5’ en de andere van 5’ naar 3’
− Lengte DNA-moleculen: uitgedrukt in baseparen of kilobasen; 1 kb = 1000 bp; lengte DNA-
moleculen kunnen sterk uiteenlopen
2.1.2 VERSCHIL GENETISCH MATERIAAL VAN PROKARYOTEN
− Samenstelling genetisch materiaal van
eukaryoten (zie genetica); enkel verschillen
pro-en eukaryoten
− Prokaryoten:
o Kernomhulsel ontbreekt, DNA ligt
vrij maar toch centraal in het
cytoplasma
o Met elektronenmicroscoop heeft
men deze plek ontdekt = nucleoïde
→ één enkel groot ringvormige DNA molecule bevat
6
INHOUDSOPGAVE
1. inleiding ...........................................................................................................................................................................3
2. genetisch materiaal .........................................................................................................................................................5
2.1 structuur dna ..................................................................................................................................................................5
2.1.1 elementen van de dna-molecule ..........................................................................................................................5
2.1.2 verschil genetisch materiaal van prokaryoten ......................................................................................................6
2.2 dna replicatie ..................................................................................................................................................................7
2.3 eiwitsynthese ..................................................................................................................................................................9
2.3.1 dna transcriptie...................................................................................................................................................10
2.3.2 enzymen en nucleïnezuren .................................................................................................................................16
2.3.3 translatie .............................................................................................................................................................20
2.4 extrachromosomaal DNA .............................................................................................................................................27
2.4.1 mitochondriaal en (chloro)plasten dna ..............................................................................................................27
2.4.2 plasmiden ...........................................................................................................................................................28
2.5 expressie van genen .....................................................................................................................................................28
2.5.1 chromosoom niveau ...........................................................................................................................................29
2.5.2 transcriptie niveau ..............................................................................................................................................30
2.5.3 RNA-processing niveau .......................................................................................................................................31
2.5.4 translatie niveau .................................................................................................................................................32
2.5.5 proteïneprocessing en degradatie niveau ..........................................................................................................33
3. veranderingen in genetisch materiaal ............................................................................................................................34
3.1 veranderingen in de genen ...........................................................................................................................................35
3.2 veranderingen in chromosomen ...................................................................................................................................37
4. biotechnologische technieken .......................................................................................................................................38
4.1 PCR (polymerase chain reaction ...................................................................................................................................38
4.1.1 principe ...............................................................................................................................................................38
4.1.2 evaluatie van de pcr-producten ..........................................................................................................................41
4.1.3 amplificeren van RNA (rt-pcr) .............................................................................................................................42
4.1.4 kwantitatieve PCR (qpcr) ....................................................................................................................................43
4.1.5 andere pcr technieken zijn .................................................................................................................................49
4.1.6 toepassingen .......................................................................................................................................................50
4.2 dna sequentie-analyse..................................................................................................................................................50
4.2.1 eerste generatie sequentieanalyse .....................................................................................................................50
4.2.2 tweede generatie sequencing (next generation sequencing) ............................................................................52
4.2.3 derde generatie sequencing (dna aflezen door een nanogaatje) .......................................................................57
4.2.4 toepassingen .......................................................................................................................................................59
4.3 genetisch profiel, dna fingerprinting ............................................................................................................................60
4.3.1 rflp fingerprinting................................................................................................................................................61
4.3.2 rapd (random amplified polymorphic DNA) .......................................................................................................62
4.3.3 aflp (amplified fragment length polymophism) ..................................................................................................63
4.4 eiwit-onderzoek ............................................................................................................................................................65
4.4.1 samenstellende aminozuren ..............................................................................................................................65
1
, 4.4.2 immunoblotting – western blotting....................................................................................................................65
4.4.3 elisa .....................................................................................................................................................................68
4.4.4 snelle antigeen test .............................................................................................................................................71
4.5 recombinant dna technologie ......................................................................................................................................72
4.5.1 ti-plasmide ..........................................................................................................................................................75
4.5.2 rna interferentie (irna of rnai) ............................................................................................................................77
4.5.3 crispr cas .............................................................................................................................................................79
2
, 1. INLEIDING
− Technologie gebaseerd op biologie
− Maakt gebruik van dieren, planten, bacteriën of andere levende wezens voor ontwikkeling van
medicijnen, voedsel of nieuwe stoffen → biologische kennis gebruiken om iets nuttig te doen
− Klassieke biotechnologie: vooral begaan met traditionele technieken om dieren en planten te
kweken + het gebruik van bacteriën, gisten en schimmels voor de productie van brood, bier, wijn en
kaas
− Moderne biotechnologie: duwt voorgaande technieken een eind verder → past eigenschappen van
bacteriën, planten en dieren aan door rechtstreeks in te grijpen op DNA (code van alle erfelijke
informatie)
o Onnoemelijk kleine structuur die alle informatie bevat om een volledig organisme op te
bouwen en correct te laten functioneren
Geneeskunde
− Meer dan 250 biotechnologische geneesmiddelen en vaccins beschikbaar
− Veel gericht op ziektes die vroeger onbehandelbaar waren
= rode biotechnologie
− Vb. insuline: vroeger uit pancreas van geslachte varkens (verschilt van menselijke insuline), nu:
menselijke insuline geproduceerd door bacteriën en gisten (GGO’s die een onuitputtelijke voorraad
insuline bieden)
Landbouw
− Opbrengst landbouwgewassen te verhogen, schade door insecten en ongedierte te voorkomen en
impact landbouw op milieu te verminderen
= groene biotechnologie
− Vb. Bt-mais en-katoen → beschermd tegen insectenvraat
Voeding
− Belangrijke rol bij productie van veel voedingsmiddelen
− Belangrijkste toepassingen: levensmiddelenindustrie → bakken van brood en produceren van
fruitsap
= witte biotechnologie
− Vb. zuivelindustrie: chymosine voor kaasproductie om melk te stremmen (oorspronkelijk uit
lebmagen van kalveren, maar is schaars en duur) → genetisch gewijzigde gistcellen produceren nu
zuiver chymosine
Industrie
− Ingezet om productieprocessen sneller en duurzamer te laten verlopen
3
, − Enzymen, bacteriën en schimmels: omgebouwd tot mini-fabriekjes → helpen bij tal van
toepassingen
= witte biotechnologie
− Vb. werking waspoeders verbeteren: specifieke enzymen toegevoegd; gros wordt aangemaakt
door genetisch gewijzigde bacteriën, schimmels en gisten; enzymen nemen deel functie zeep over
op een efficiënte manier → wasgoed is sneller proper en kan bij lagere temperatuur gewassen
worden met minder water
− Vb. papier bleken: vroeger met chemische middelen zoals chloor, nu kan dat op natuurlijke
manieren laccase is verantwoordelijk voor abraak moleculen die zorgen voor de bruine kleur van
papierpulp → laccase ingebouwd in DNA van gisten → gisten worden gebruikt om chloorvrij
papier te bleken
− Vb. leerlooien
Wetenschappelijk onderzoek
− Wetenschappers gebruiken technieken van biotechnologie om inzicht te verwerven in hoe het
leven in elkaar zit; tot fijnste detail
− Gebruik van bacteriën, schimmels en proefdieren
− Deze kennis levert inzicht in waarom de ene mens ziek wordt en de andere niet, leer ons hoe
planten groeien, hoe we gisteren kunen aanpassen
− Deze kennis kan verder toegepast worden in geneeskunde, landbouw, voeding en industrie
4
,2. GENETISCH MATERIAAL
− Genen moesten opgebouwd zijn uit moleculen; pas tegen eind 19 e eeuw werd duidelijk dat
overerfbare eigenschappen zich bevonden op chromosomen, deze structuren werden duidelijk bij
het delen van de kern
− Elke cel bevat genetisch materiaal = DNA = desoxyribonucleïnezuur
− Elke cel: 46 chromosomen → dragers van erfelijk materiaal (opgebouwd uit genen die coderen voor
eiwitten
o Elk eiwitproduct vervult een specifieke functie → eiwitten bepalen samen de kenmerken
van elke levende cel
− DNA beïnvloedt het uitzicht en functioneren van een cel en van het organisme dat uit die cellen is
opgebouwd
o Deze informatie wordt doorgegeven aan dochtercellen bij
gewone celdeling en aan de nakomelingen bij een
geslachtelijke voortplanting: DNA is de drager van erfelijke
informatie
2.1 STRUCTUUR DNA
2.1.1 ELEMENTEN VAN DE DNA-MOLECULE
− DNA = desoxyribonucleïnezuur → 2 complementaire strengen die schroefvormig rond elkaar
gewonden zijn tot dubbele helix-structuur
o Streng = aaneenschakeling van nucleotiden
• Bestaan uit een pentosesuiker (desoxyribose)
o Op de 2e koolstof een H (desoxy) bij het RNA is
dit een hydroxylgroep (OH) dus geen
voorvoegsel desoxy
• Een fosfaatgroep
• Ene purine of pyrimidinebase
o Niet verrassend want een helix-structuur is veelvoorkomend bij polymeren met herhalende
eenheden; volgt uit het feit dat op deze manier de eenheden ruimtelijk het verst uit elkaar
geplaatst kunnen worden
− Wel verrassend: een dubbele helix met alle basen aan de binnenzijde en suikerfosfaten aan de
buitenzijde
o De oriëntatie van de basen aan de binnenzijde liet uitschijnen dat de basen van de ene streng
zeer dicht tegen de andere moesten liggen → kon enkel mogelijk zijn als er paren gevormd
werden tussen een grote purine base (A of G met een dubbel ring) op de ene streng en een
kleinere pyrimidene base (T of G met een enkele ring)
o Grote purine basen:
▪ Adenine en guanine
o Kleinere pyrimidinebasen:
5
, ▪ Cytosine en thymine (uracyl bij RNA)
o Binding tussen purine en pyrimidine: waterstofbindingen; bij moleculaire opbouw =
complementaire basenparen gevormd (complementariteit)
− Opbouw gebeurt door toevoegen van desoxyribonucleosidetrifosfaat
o Deze trifosfaatgroep is gebonden aan 5e koolstofatoom van de suikergroep = 5’ en deze zal
2 fosfaatgroepen afsplitsen (= pyrofosfaat) en zich hechten aan het 3e koolstofatoom = 3’
van de laatste nucleotide van de DNA-streng
o Gevolg: DNA-streng zal altijd beginnen met een vrije fosfaatgroep op de eerste 5’ en zal
steeds aangroeien in de 3’ richting (altijd van 5’ naar 3’)
− Dubbele helix DNA kan men voorstellen als een touwladder die om de lengteas gedraaid is waarbij
de zijkanten door fosfaat-suikerbinding gevormd worden
o ‘sporten’ van de lader zijn de complementaire baseparen
− De complementaire strengen in de dubbele DN-helix zijn antiparallel opgebouwd: ene streng loopt
van 3’ naar 5’ en de andere van 5’ naar 3’
− Lengte DNA-moleculen: uitgedrukt in baseparen of kilobasen; 1 kb = 1000 bp; lengte DNA-
moleculen kunnen sterk uiteenlopen
2.1.2 VERSCHIL GENETISCH MATERIAAL VAN PROKARYOTEN
− Samenstelling genetisch materiaal van
eukaryoten (zie genetica); enkel verschillen
pro-en eukaryoten
− Prokaryoten:
o Kernomhulsel ontbreekt, DNA ligt
vrij maar toch centraal in het
cytoplasma
o Met elektronenmicroscoop heeft
men deze plek ontdekt = nucleoïde
→ één enkel groot ringvormige DNA molecule bevat
6
