1 Transformation of plants
1.1 The Agrobacterium/plant cell interaction
1.1.1 Agrobacterium tumefaciens – pathogen and useful tool
Agrobacterium tumefaciens:
• Is een plantenpathogen die tumoren veroorzaakt bij tweezaadlobbige angiospermen en
gymnospermen (ong. 60%)
• Door de tumor-inducerende eigenschap is het een hulpmiddel voor het introduceren van genen in
planten voor onderzoek en landbouwdoeleinden
• Is een gram-negatieve bodembacterie van de Rhizobiaceae-familie die een kroongal-ziekte
veroorzaakt
• Kroongallen:
o Zijn tumoren die ontstaan op de kruin/kroon van de plant (verbinding wortel-stam), de
stengel & oppervlakkige wortels
o De tumor veroorzaakt een verstoring van de opname van nutriënten door de plant
• Het tumorweefsel kan zich vermenigvuldigen op een medium zonder fytohormonen
o Zelfs als er geen bacteriën aanwezig is in het medium
• Toepassingen:
o Fundamenteel:
▪ Promotor + reporter gen (GUS: b-glucuronidase → enzyme)
• GUS: om plant te selecteren
• X-gluc wordt door GUS omgezet in blauw precipitaat
• Economisch belangrijke gastheren: druiven- en fruitbomen
Oranje driehoek: New roots WT en WT + Bt-gene (Bt: toxine dat insectenlarve dood)
Kunstmatige inenting van een plantenstengel met een wildtype Agrobacterium tumefaciens (rechter
afbeelding)
• Na een paar weken ontstaat er een tumor op de stam
Experiment:
• IC van bladeren met medium + 2 fyto-hormonen
o Auxine 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur (2,4-D)
o Cytokinine-zeatine
• Resultaat:
o Door de hormonen begonnen de bladeren zich te delen → Er ontstaat callusen op de
explantaten van Medicago truncatula-bladeren
• Rechts: niet gedifferentieerde cellen → callus
o Callus zal enkel gevormd worden als de 2 hormonen aanwezig zijn
o Callus ≠ tumor
1
,2
• Waarom heet dat een tumor? → Verschil tussen callus en tumor!
o Blad kweken zonder 2 hormonen → geen groei → hormonen is belangrijk voor groei
o Stuk tumoren kan uitgesneden worden en uitgeplaats worden op medium zonder
hormonen → er is wel groei
Voorbeelden van natuurlijke infecties met Agrobacterium tumefaciens:
1.1.2 Ontdekking agrobacterium tumefaciens
Townsend 1907: Toonde aan dat kroongal veroorzaakt werd door een bacterie (A.T.)
• Townsend isoleerde een bacterie uit gallen van madeliefjes
• Vervolgens enten hij deze bacteriën op andere planten → vorming gallen
o Plaatste extracten op medium en isoleerde de bacterie en vervolgens inoculeerde hij de
bacteriën op de gezonde plant
▪ Resultaat: gall vorming op plant
• Conclusie: Agrobacterium tumefaciens (A.T) was verantwoordelijk voor vorming gall op plant
1.1.3 Agrobacterium-induced galls do not require bacterial persistence
Agrobacterium geïnduceerde gallen vereisen geen bacteriële persistentie:
• Toonde aan dat de bacteriën zorgde voor de vorming van de tumoren
• Toonde aan dat galweefsels zonder bacteriën voor onbepaalde tijd in de kweek kunnen blijven
bestaan
o Bij andere door pathogenen geïnduceerde neoplastische gezwellen is de aanwezigheid van
de pathogeen vereist
• Braun heeft fundamentele ontdekkingen gedaan over hoe Agrobacterium plantencellen
transformeert
o Hij kon de agrobacterium T. vermoorde
o Toonde aan dat agrobacterium een tumor inducing principe bevat die de plantencellen kon
transformeren van gezonde cellen → tumorcellen
1.1.3.1 The “tumour inducing principle” (TIP)
Het “tumorinducerende principe” (TIP)
• De eerste aanwijzing van TIP:
, o Er is een verband tussen virulentie (het vermogen om tumoren te induceren) en
aanwezigheid van een groot plasmide.
o Onderzoek naar virulente en avirulente stammen:
▪ In de virulente stammen was er een groot plasmide (150.000 – 200.000bp)
aanwezig
▪ In de avirulente stammen was er geen groot plasmide aanwezig
▪ Experiment: conjugatie tussen virulente en avirulente stam
▪ Resultaat na conjugatie: avirulente stam werd virulent
• Virulente stam onstond doordat avirulente stammen het groot plasmide
door conjugatie kregen (bevatten Ti-plasmiden)
▪ Conclusie: Ti-plasmiden zijn aanwezig in virulente stammen
o Plasmiden die virulentie veroorzaken: Tumor-inducerende of Ti-plasmiden
▪ Het Ti-plasmide bestaat uit transfer-DNA (T-DNA)
▪ Is het gen dat wordt geïntegreerd in het plantengenoom
• Vervolgens werd de overdracht van een deel van het Ti-plasmide (T-DNA) naar plantencellen
aangetoond = Interkingdom DNA-overdracht
• Schema experiment overdracht T-DNA in genoom:
o Vorming wonde aan de stam van plant
o Hierdoor werd A.T aangetrokken waardoor de bacteriën aan de wonde bind
o Vervolgens word een kopie van de T-DNA gekopieerd
▪ T-DNA wordt getransporteerd naar nucleus en geïntegreerd in chromosomaal DNA
+ tot expressie gebracht → vorming tumor (WT stammen)
o Tumor gedeelte kan opgegroeid wordt op medium
▪ Op medium inoculeren (zonder hormonen) en vervolgens bacteriën doden
▪ Hierdoor kan tumorweefsel verder opgroeien
▪ T-DNA bevat genen die zorgen voor een productie van auxine en cytokine →
zorgen voor vorming tumor
Genen van T-DNA in WT A. tumefaciens:
• T-DNA bestaat uit
o 2 fytohormoon-biosynthesegenen:
▪ iPt-gen (isopentenyltransferase): cytokinine-biosynthese
• iPt-gen bevat een constitutief promotor (altijd actief): zorgt voor productie
cytokine
▪ iaaM-gen (Trp → indoolacetamide) en iaaH (indoolacetamide → indolazijnzuur):
auxine biosynthese
o Opine-genen: energiebron
3
, 4
• Niet-gecontroleerde overproductie van cytokinine + auxine → tumorvorming.
Fytohormoon-biosynthesegenen komen enkel tot expressie in planten
• De hormoonbiosynthesegenen zijn aanwezig op een bacterieel plasmide en staan onder controle
van eukaryotische expressiesignalen (promotor):
o Promoter: eukaryotisch
o 3’-polyadenylatiesignaal (AATAAA):
• Verschil tussen prokaryotische en eukaryotische genen
o Transcriptie:
▪ RNA Polymerase is specifiek voor prokaryoten en eukaryoten
▪ Geen intronen in iPt-gen en iaaM-gen
o Translatie:
▪ Eukaryoten:
• -3: A/G
• +4: G
• Bevat
o 5’CAP: Ribosomen binden en scannen om de eerste AUG te vinden
o 3’Poly-A-staart
▪ Prokayoten: Geen CAP en staart
1.1.3.2 Cytokine
Vorming actief cytokine (Chemische structuren niet kennen)
• Zeatine: meest voorkomende cytokine
o Cytokine is afkomstig van AMP en DMAPP → vormen [9R-5’P]iP
▪ [9R-5’P]iP bestaat uit:
• 5C-atomen met dubbele binding
• 2 fosfaatgroepen
o AMP + DMAPP → [9R-5’P]iP →1 fosfaatgroep en ribose verwijdering → vorming actief iP of
zeatine
▪ Zeatine heeft een extra omzetting tot [9R-5’P]iP → [9R-5’P]Z
Voorbeelden natuurlijke en synthetische auxine (ter info)
• Belangrijkste: is zeatine of niet gehydroxyleerde alternatief: iP
1.1 The Agrobacterium/plant cell interaction
1.1.1 Agrobacterium tumefaciens – pathogen and useful tool
Agrobacterium tumefaciens:
• Is een plantenpathogen die tumoren veroorzaakt bij tweezaadlobbige angiospermen en
gymnospermen (ong. 60%)
• Door de tumor-inducerende eigenschap is het een hulpmiddel voor het introduceren van genen in
planten voor onderzoek en landbouwdoeleinden
• Is een gram-negatieve bodembacterie van de Rhizobiaceae-familie die een kroongal-ziekte
veroorzaakt
• Kroongallen:
o Zijn tumoren die ontstaan op de kruin/kroon van de plant (verbinding wortel-stam), de
stengel & oppervlakkige wortels
o De tumor veroorzaakt een verstoring van de opname van nutriënten door de plant
• Het tumorweefsel kan zich vermenigvuldigen op een medium zonder fytohormonen
o Zelfs als er geen bacteriën aanwezig is in het medium
• Toepassingen:
o Fundamenteel:
▪ Promotor + reporter gen (GUS: b-glucuronidase → enzyme)
• GUS: om plant te selecteren
• X-gluc wordt door GUS omgezet in blauw precipitaat
• Economisch belangrijke gastheren: druiven- en fruitbomen
Oranje driehoek: New roots WT en WT + Bt-gene (Bt: toxine dat insectenlarve dood)
Kunstmatige inenting van een plantenstengel met een wildtype Agrobacterium tumefaciens (rechter
afbeelding)
• Na een paar weken ontstaat er een tumor op de stam
Experiment:
• IC van bladeren met medium + 2 fyto-hormonen
o Auxine 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur (2,4-D)
o Cytokinine-zeatine
• Resultaat:
o Door de hormonen begonnen de bladeren zich te delen → Er ontstaat callusen op de
explantaten van Medicago truncatula-bladeren
• Rechts: niet gedifferentieerde cellen → callus
o Callus zal enkel gevormd worden als de 2 hormonen aanwezig zijn
o Callus ≠ tumor
1
,2
• Waarom heet dat een tumor? → Verschil tussen callus en tumor!
o Blad kweken zonder 2 hormonen → geen groei → hormonen is belangrijk voor groei
o Stuk tumoren kan uitgesneden worden en uitgeplaats worden op medium zonder
hormonen → er is wel groei
Voorbeelden van natuurlijke infecties met Agrobacterium tumefaciens:
1.1.2 Ontdekking agrobacterium tumefaciens
Townsend 1907: Toonde aan dat kroongal veroorzaakt werd door een bacterie (A.T.)
• Townsend isoleerde een bacterie uit gallen van madeliefjes
• Vervolgens enten hij deze bacteriën op andere planten → vorming gallen
o Plaatste extracten op medium en isoleerde de bacterie en vervolgens inoculeerde hij de
bacteriën op de gezonde plant
▪ Resultaat: gall vorming op plant
• Conclusie: Agrobacterium tumefaciens (A.T) was verantwoordelijk voor vorming gall op plant
1.1.3 Agrobacterium-induced galls do not require bacterial persistence
Agrobacterium geïnduceerde gallen vereisen geen bacteriële persistentie:
• Toonde aan dat de bacteriën zorgde voor de vorming van de tumoren
• Toonde aan dat galweefsels zonder bacteriën voor onbepaalde tijd in de kweek kunnen blijven
bestaan
o Bij andere door pathogenen geïnduceerde neoplastische gezwellen is de aanwezigheid van
de pathogeen vereist
• Braun heeft fundamentele ontdekkingen gedaan over hoe Agrobacterium plantencellen
transformeert
o Hij kon de agrobacterium T. vermoorde
o Toonde aan dat agrobacterium een tumor inducing principe bevat die de plantencellen kon
transformeren van gezonde cellen → tumorcellen
1.1.3.1 The “tumour inducing principle” (TIP)
Het “tumorinducerende principe” (TIP)
• De eerste aanwijzing van TIP:
, o Er is een verband tussen virulentie (het vermogen om tumoren te induceren) en
aanwezigheid van een groot plasmide.
o Onderzoek naar virulente en avirulente stammen:
▪ In de virulente stammen was er een groot plasmide (150.000 – 200.000bp)
aanwezig
▪ In de avirulente stammen was er geen groot plasmide aanwezig
▪ Experiment: conjugatie tussen virulente en avirulente stam
▪ Resultaat na conjugatie: avirulente stam werd virulent
• Virulente stam onstond doordat avirulente stammen het groot plasmide
door conjugatie kregen (bevatten Ti-plasmiden)
▪ Conclusie: Ti-plasmiden zijn aanwezig in virulente stammen
o Plasmiden die virulentie veroorzaken: Tumor-inducerende of Ti-plasmiden
▪ Het Ti-plasmide bestaat uit transfer-DNA (T-DNA)
▪ Is het gen dat wordt geïntegreerd in het plantengenoom
• Vervolgens werd de overdracht van een deel van het Ti-plasmide (T-DNA) naar plantencellen
aangetoond = Interkingdom DNA-overdracht
• Schema experiment overdracht T-DNA in genoom:
o Vorming wonde aan de stam van plant
o Hierdoor werd A.T aangetrokken waardoor de bacteriën aan de wonde bind
o Vervolgens word een kopie van de T-DNA gekopieerd
▪ T-DNA wordt getransporteerd naar nucleus en geïntegreerd in chromosomaal DNA
+ tot expressie gebracht → vorming tumor (WT stammen)
o Tumor gedeelte kan opgegroeid wordt op medium
▪ Op medium inoculeren (zonder hormonen) en vervolgens bacteriën doden
▪ Hierdoor kan tumorweefsel verder opgroeien
▪ T-DNA bevat genen die zorgen voor een productie van auxine en cytokine →
zorgen voor vorming tumor
Genen van T-DNA in WT A. tumefaciens:
• T-DNA bestaat uit
o 2 fytohormoon-biosynthesegenen:
▪ iPt-gen (isopentenyltransferase): cytokinine-biosynthese
• iPt-gen bevat een constitutief promotor (altijd actief): zorgt voor productie
cytokine
▪ iaaM-gen (Trp → indoolacetamide) en iaaH (indoolacetamide → indolazijnzuur):
auxine biosynthese
o Opine-genen: energiebron
3
, 4
• Niet-gecontroleerde overproductie van cytokinine + auxine → tumorvorming.
Fytohormoon-biosynthesegenen komen enkel tot expressie in planten
• De hormoonbiosynthesegenen zijn aanwezig op een bacterieel plasmide en staan onder controle
van eukaryotische expressiesignalen (promotor):
o Promoter: eukaryotisch
o 3’-polyadenylatiesignaal (AATAAA):
• Verschil tussen prokaryotische en eukaryotische genen
o Transcriptie:
▪ RNA Polymerase is specifiek voor prokaryoten en eukaryoten
▪ Geen intronen in iPt-gen en iaaM-gen
o Translatie:
▪ Eukaryoten:
• -3: A/G
• +4: G
• Bevat
o 5’CAP: Ribosomen binden en scannen om de eerste AUG te vinden
o 3’Poly-A-staart
▪ Prokayoten: Geen CAP en staart
1.1.3.2 Cytokine
Vorming actief cytokine (Chemische structuren niet kennen)
• Zeatine: meest voorkomende cytokine
o Cytokine is afkomstig van AMP en DMAPP → vormen [9R-5’P]iP
▪ [9R-5’P]iP bestaat uit:
• 5C-atomen met dubbele binding
• 2 fosfaatgroepen
o AMP + DMAPP → [9R-5’P]iP →1 fosfaatgroep en ribose verwijdering → vorming actief iP of
zeatine
▪ Zeatine heeft een extra omzetting tot [9R-5’P]iP → [9R-5’P]Z
Voorbeelden natuurlijke en synthetische auxine (ter info)
• Belangrijkste: is zeatine of niet gehydroxyleerde alternatief: iP
