Cytologie
Inhoudsopgave
H1: Technieken........................................................................................................................4
Prepareren en observeren van cellen en weefsels .................................................................4
Historiek ..........................................................................................................................4
Celcultivering ......................................................................................................................4
Cultuurcondities ..................................................................................................................4
Cultuurrecipiënten ..............................................................................................................4
Groeisubstraten en -procedures ...........................................................................................5
Celdensiteits-afhankelijke inhibitie .......................................................................................5
Procedure van celtransfer ....................................................................................................5
Kwaliteitscontrole ................................................................................................................6
Prepareren...........................................................................................................................7
Lichtmicroscopie .................................................................................................................7
Elektronenmicroscoop ....................................................................................................... 12
H2: Bloed .............................................................................................................................. 14
Bloed ................................................................................................................................ 14
Bloedcellen ....................................................................................................................... 15
Rode bloedlichaampjes – erythrocyten............................................................................ 15
Witte bloedcellen – Leukocyten ...................................................................................... 16
Bloedplaatjes – Trombocyten .......................................................................................... 19
Immunologie ..................................................................................................................... 19
H3: De organellen .................................................................................................................. 24
Membranen ....................................................................................................................... 24
Mitochondriën ................................................................................................................... 26
Endoplasmatisch reticulum ............................................................................................... 29
Golgi complex.................................................................................................................... 35
Cytosomen: Lysosomen ..................................................................................................... 39
Cytosomen: Peroxisomen .................................................................................................. 41
H4: De kern ........................................................................................................................... 42
Chromatine ....................................................................................................................... 42
De nucleolus ..................................................................................................................... 43
De kernenvelop.................................................................................................................. 43
1
, De kernporiën .................................................................................................................... 44
Celdeling ........................................................................................................................... 46
Celdood ............................................................................................................................ 47
H5: Cytoskelet....................................................................................................................... 52
Actine- of microfilamenten in een oogopslag ...................................................................... 52
Intermediaire filamenten in een oogopslag ......................................................................... 53
Microtubuli in een oogopslag .............................................................................................. 53
Actine- of microfilamenten ................................................................................................. 53
Opbouw ......................................................................................................................... 53
Actine-bindende eiwitten ................................................................................................ 54
Cel-substraat adhesiemoleculen........................................................................................ 56
Intermediaire filamenten .................................................................................................... 57
Desmosomen ................................................................................................................ 57
Lamine eiwitten.............................................................................................................. 57
Microtubuli .................................................................................................................... 57
H6: Celadhesie ..................................................................................................................... 62
Intercellulaire juncties van de gepolariseerde epitheelcel als representatieve organisatie..... 62
Tight junction of zonulaoccudens (ZO) ............................................................................ 62
Adherensjunction (AJ) of zonulaadherens (ZA) of belt desmosome ................................... 63
Desmosomen of spot desmosomen of macula adherens ................................................. 65
Gap junctions................................................................................................................. 66
Families van cel-cel adhesiemoleculen .............................................................................. 66
Inflammatie als illustratie van de belangrijke rol van intercellulaire adhesieprocessen
(belangrijk!!!) ..................................................................................................................... 68
H7: Extracellulaire matrix (ECM) ............................................................................................. 69
Cellen integreren in weefsels .............................................................................................. 69
Functies van ECM .............................................................................................................. 70
CAM’s niet alleen belangrijk voor adhesie, er worden ook signaalwegen in de cel geactiveerd
......................................................................................................................................... 70
Mechanosensor- eiwitten die reageren op mechanische krachten ....................................... 70
De basale lamina ............................................................................................................... 71
Laminine (LM): ............................................................................................................... 71
Collageen (type IV) ......................................................................................................... 71
Bindweefsel ....................................................................................................................... 71
2
, Glycosaminoglycanen (GAG’s) ........................................................................................ 72
Aanwezige eiwitten ............................................................................................................ 72
Adhesieve interacties in beweeglijke en niet-beweeglijke cellen: ...................................... 73
Conformaties van integrines ........................................................................................... 73
3
,H1: Technieken
Prepareren en observeren van cellen en weefsels
Doel: cellen en weefsels observeerbaar maken voor LM of EM
Probleem: weinig licht (elektronen) doorlatend weinig contrast in biologisch materiaal
Methodes :
– Fixeren
– Inbedden en snijden
– Kleuren of contrasteren
Historiek
1. 3D cultuur (rond 1900)
2. 2D monolaagculturen: “simuleren” 3D organen/weefsel terwijl echte 3D culturenenkel
uitzonderlijk zijn ➔ vb. tumor
Oorspronkelijk uit organen, in EMEM (Earle’s minimum essential medium)
3. Stabiele cellijnen: geïmmortaliseerde cellen
Te bereiken door: tumor of crisis (selectie)
Celcultivering
Cellijn maken:
Stappen:
- Het weefels zal enzymatisch worden behandeld.
- Cellen zakken uit of worden naar bodem
gecentrifugeerd.
- Cellen zullen worden uitgeplaat in een
groeirecipient (hier een petridish). Hopelijk overleven
cellen deze behandeling en zijn ze in staat uit te
groeien.
Cultuurcondities
MEM (Minimum Essential Medium) bevat:
• isotonische zouten (o.a. NaHCO3/H2CO3-buffer zoals in bloed),
• energiebron (glucose),
• essentiële (d.i. niet zelf synthetiseerbare) aminozuren en vitamines,
• serum (nagenoeg essentieel, maar weliswaar een duur natuurproduct met
kwaliteitsvariatie!).
Cultuurrecipiënten
Gesloten flessen, open platen, rollerflessen in warme omgeving, CO2 oven met cultuurplaten
4
,Groeisubstraten en -procedures
• Is fysische drager, maar beschermt ook tegen anoïkis (=vorm van apoptose)
• Essentieel voor adherente celcultures (ze groeien op bodem waar je ze hebt gelegd)
• Proberen om in vitro (in glas) condities vergelijkbaar te maken met in vivo (in lichaam)
situatie daarvoor kan het zijn dat we cellen op een eiwit van de ECM (extra-cellulaire
matrix) laten groeien.
• Materie: glas (- geladen), polystereen (fysische drager), coatings (om in vivo na te
bootsen)
Doel:
• Aspecifieke fysische interactie; toelaten van cellulaire adhesie en celspreiding
• Specifieke functionele interactie met onderliggende cellen en E.C.M. → differentiatie-
inductie door stimulatie vanwege de ‘basaal membraan’ of basale lamina
Celdensiteits-afhankelijke inhibitie
Cellen in cultuur blijven zich delen totdat ze een volledig bedekkende laag vormen op het
oppervlak (een 2D monolaag). Vervolgens treedt er 'contactinhibitie' op, wat betekent dat de
celgroei stopt, onder andere door de concurrentie om groeifactoren (mitogenen).
• Groei in 2D en 3D culturen
bootsen de in vivo omgeving na
Procedure van celtransfer
• gebeurt door eenvoudige verdunning bij suspensiecultures
• bij adherente cellen gebeurt de celtransfer eens confluentie van de cel- (mono)-laag
optreedt (gemiddeld om de 3 à 7 dagen)
Hiertoe wordt de culture behandeld met trypsine/EDTA:
• trypsine = maagprotease, dat bij een korte behandeling de oppervlakte-eiwitten van
de cellen degradeert
• EDTA: bindt calcium en magnesium, wat interfereert met zowel intercellulaire
adhesie als cel-substraat-binding.
• In geschikte condities komen de cellen los van het substraat èn van
elkaar, en vormeneen suspensie van levende opgebolde cellen.
Optimaal: monocellulair
Uitverdund en uitgezaaid: 1/3 normaal, 1/30 tumoraal
• Resterend trypsine wordt geïnhibeerd door protease-inhibitoren (in serum)
5
, - Cellen zakken uit oiv zwaartekracht
- Progressieve spreiding over het substraat
- Gaan sterke binding aan met substraat
Stamcel= Een cel die het vermogen heeft om zich voortdurend te delen en te differentiëren
(ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen/weefsels.
Belangrijke eigenschappen:
1. Het vermogen tot zelfvernieuwing, waarbij ze zichzelf delen en kopieën van zichzelf
maken
2. Het vermogen om te differentiëren, waardoor de volwassen celtypen ontstaan die onze
organen en weefsels vormen.
Een stamcel is "totipotent" als deze de potentie heeft om zich tot een volledige foetus te
ontwikkelen.
Een pluripotente stamcel is een cel die zich kan ontwikkelen tot elk type cel in het lichaam,
maar niet in staat is om een compleet organisme te vormen. (We kunnen organen maken)
Een multipotente stamcel is een cel die zich kan differentiëren in meerdere celtypen binnen
een specifiek weefsel of orgaansysteem, maar niet in alle celtypen van het lichaam. (Maken
onze huid aan)
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)
• Via bloed, urine -> epitheelcellen uithalen -> bewerken met
cocktail van eiwitten -> cellen van de patiënt -> specifieke
pluripotente stamcellen -> differentiatie starten,
geneesmiddelen uittesten, cellen gezond maken
Kwaliteitscontrole
Contaminatie (=ongewenste aanwezigheid van ongewenste stoffen) met micro-organismen
• Probleem omwille van hun snelle groei in de rijke groeimilieus
• Bacteriën, schimmels, gisten…
• Moeilijk detecteerbaar
Contaminatie met vreemde cellen
• Het treedt frequenter op dan men beseft
• Detectie van contaminaties is mogelijk door o.a.
genetische fingerprinting of karyotypering
6
Inhoudsopgave
H1: Technieken........................................................................................................................4
Prepareren en observeren van cellen en weefsels .................................................................4
Historiek ..........................................................................................................................4
Celcultivering ......................................................................................................................4
Cultuurcondities ..................................................................................................................4
Cultuurrecipiënten ..............................................................................................................4
Groeisubstraten en -procedures ...........................................................................................5
Celdensiteits-afhankelijke inhibitie .......................................................................................5
Procedure van celtransfer ....................................................................................................5
Kwaliteitscontrole ................................................................................................................6
Prepareren...........................................................................................................................7
Lichtmicroscopie .................................................................................................................7
Elektronenmicroscoop ....................................................................................................... 12
H2: Bloed .............................................................................................................................. 14
Bloed ................................................................................................................................ 14
Bloedcellen ....................................................................................................................... 15
Rode bloedlichaampjes – erythrocyten............................................................................ 15
Witte bloedcellen – Leukocyten ...................................................................................... 16
Bloedplaatjes – Trombocyten .......................................................................................... 19
Immunologie ..................................................................................................................... 19
H3: De organellen .................................................................................................................. 24
Membranen ....................................................................................................................... 24
Mitochondriën ................................................................................................................... 26
Endoplasmatisch reticulum ............................................................................................... 29
Golgi complex.................................................................................................................... 35
Cytosomen: Lysosomen ..................................................................................................... 39
Cytosomen: Peroxisomen .................................................................................................. 41
H4: De kern ........................................................................................................................... 42
Chromatine ....................................................................................................................... 42
De nucleolus ..................................................................................................................... 43
De kernenvelop.................................................................................................................. 43
1
, De kernporiën .................................................................................................................... 44
Celdeling ........................................................................................................................... 46
Celdood ............................................................................................................................ 47
H5: Cytoskelet....................................................................................................................... 52
Actine- of microfilamenten in een oogopslag ...................................................................... 52
Intermediaire filamenten in een oogopslag ......................................................................... 53
Microtubuli in een oogopslag .............................................................................................. 53
Actine- of microfilamenten ................................................................................................. 53
Opbouw ......................................................................................................................... 53
Actine-bindende eiwitten ................................................................................................ 54
Cel-substraat adhesiemoleculen........................................................................................ 56
Intermediaire filamenten .................................................................................................... 57
Desmosomen ................................................................................................................ 57
Lamine eiwitten.............................................................................................................. 57
Microtubuli .................................................................................................................... 57
H6: Celadhesie ..................................................................................................................... 62
Intercellulaire juncties van de gepolariseerde epitheelcel als representatieve organisatie..... 62
Tight junction of zonulaoccudens (ZO) ............................................................................ 62
Adherensjunction (AJ) of zonulaadherens (ZA) of belt desmosome ................................... 63
Desmosomen of spot desmosomen of macula adherens ................................................. 65
Gap junctions................................................................................................................. 66
Families van cel-cel adhesiemoleculen .............................................................................. 66
Inflammatie als illustratie van de belangrijke rol van intercellulaire adhesieprocessen
(belangrijk!!!) ..................................................................................................................... 68
H7: Extracellulaire matrix (ECM) ............................................................................................. 69
Cellen integreren in weefsels .............................................................................................. 69
Functies van ECM .............................................................................................................. 70
CAM’s niet alleen belangrijk voor adhesie, er worden ook signaalwegen in de cel geactiveerd
......................................................................................................................................... 70
Mechanosensor- eiwitten die reageren op mechanische krachten ....................................... 70
De basale lamina ............................................................................................................... 71
Laminine (LM): ............................................................................................................... 71
Collageen (type IV) ......................................................................................................... 71
Bindweefsel ....................................................................................................................... 71
2
, Glycosaminoglycanen (GAG’s) ........................................................................................ 72
Aanwezige eiwitten ............................................................................................................ 72
Adhesieve interacties in beweeglijke en niet-beweeglijke cellen: ...................................... 73
Conformaties van integrines ........................................................................................... 73
3
,H1: Technieken
Prepareren en observeren van cellen en weefsels
Doel: cellen en weefsels observeerbaar maken voor LM of EM
Probleem: weinig licht (elektronen) doorlatend weinig contrast in biologisch materiaal
Methodes :
– Fixeren
– Inbedden en snijden
– Kleuren of contrasteren
Historiek
1. 3D cultuur (rond 1900)
2. 2D monolaagculturen: “simuleren” 3D organen/weefsel terwijl echte 3D culturenenkel
uitzonderlijk zijn ➔ vb. tumor
Oorspronkelijk uit organen, in EMEM (Earle’s minimum essential medium)
3. Stabiele cellijnen: geïmmortaliseerde cellen
Te bereiken door: tumor of crisis (selectie)
Celcultivering
Cellijn maken:
Stappen:
- Het weefels zal enzymatisch worden behandeld.
- Cellen zakken uit of worden naar bodem
gecentrifugeerd.
- Cellen zullen worden uitgeplaat in een
groeirecipient (hier een petridish). Hopelijk overleven
cellen deze behandeling en zijn ze in staat uit te
groeien.
Cultuurcondities
MEM (Minimum Essential Medium) bevat:
• isotonische zouten (o.a. NaHCO3/H2CO3-buffer zoals in bloed),
• energiebron (glucose),
• essentiële (d.i. niet zelf synthetiseerbare) aminozuren en vitamines,
• serum (nagenoeg essentieel, maar weliswaar een duur natuurproduct met
kwaliteitsvariatie!).
Cultuurrecipiënten
Gesloten flessen, open platen, rollerflessen in warme omgeving, CO2 oven met cultuurplaten
4
,Groeisubstraten en -procedures
• Is fysische drager, maar beschermt ook tegen anoïkis (=vorm van apoptose)
• Essentieel voor adherente celcultures (ze groeien op bodem waar je ze hebt gelegd)
• Proberen om in vitro (in glas) condities vergelijkbaar te maken met in vivo (in lichaam)
situatie daarvoor kan het zijn dat we cellen op een eiwit van de ECM (extra-cellulaire
matrix) laten groeien.
• Materie: glas (- geladen), polystereen (fysische drager), coatings (om in vivo na te
bootsen)
Doel:
• Aspecifieke fysische interactie; toelaten van cellulaire adhesie en celspreiding
• Specifieke functionele interactie met onderliggende cellen en E.C.M. → differentiatie-
inductie door stimulatie vanwege de ‘basaal membraan’ of basale lamina
Celdensiteits-afhankelijke inhibitie
Cellen in cultuur blijven zich delen totdat ze een volledig bedekkende laag vormen op het
oppervlak (een 2D monolaag). Vervolgens treedt er 'contactinhibitie' op, wat betekent dat de
celgroei stopt, onder andere door de concurrentie om groeifactoren (mitogenen).
• Groei in 2D en 3D culturen
bootsen de in vivo omgeving na
Procedure van celtransfer
• gebeurt door eenvoudige verdunning bij suspensiecultures
• bij adherente cellen gebeurt de celtransfer eens confluentie van de cel- (mono)-laag
optreedt (gemiddeld om de 3 à 7 dagen)
Hiertoe wordt de culture behandeld met trypsine/EDTA:
• trypsine = maagprotease, dat bij een korte behandeling de oppervlakte-eiwitten van
de cellen degradeert
• EDTA: bindt calcium en magnesium, wat interfereert met zowel intercellulaire
adhesie als cel-substraat-binding.
• In geschikte condities komen de cellen los van het substraat èn van
elkaar, en vormeneen suspensie van levende opgebolde cellen.
Optimaal: monocellulair
Uitverdund en uitgezaaid: 1/3 normaal, 1/30 tumoraal
• Resterend trypsine wordt geïnhibeerd door protease-inhibitoren (in serum)
5
, - Cellen zakken uit oiv zwaartekracht
- Progressieve spreiding over het substraat
- Gaan sterke binding aan met substraat
Stamcel= Een cel die het vermogen heeft om zich voortdurend te delen en te differentiëren
(ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen/weefsels.
Belangrijke eigenschappen:
1. Het vermogen tot zelfvernieuwing, waarbij ze zichzelf delen en kopieën van zichzelf
maken
2. Het vermogen om te differentiëren, waardoor de volwassen celtypen ontstaan die onze
organen en weefsels vormen.
Een stamcel is "totipotent" als deze de potentie heeft om zich tot een volledige foetus te
ontwikkelen.
Een pluripotente stamcel is een cel die zich kan ontwikkelen tot elk type cel in het lichaam,
maar niet in staat is om een compleet organisme te vormen. (We kunnen organen maken)
Een multipotente stamcel is een cel die zich kan differentiëren in meerdere celtypen binnen
een specifiek weefsel of orgaansysteem, maar niet in alle celtypen van het lichaam. (Maken
onze huid aan)
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)
• Via bloed, urine -> epitheelcellen uithalen -> bewerken met
cocktail van eiwitten -> cellen van de patiënt -> specifieke
pluripotente stamcellen -> differentiatie starten,
geneesmiddelen uittesten, cellen gezond maken
Kwaliteitscontrole
Contaminatie (=ongewenste aanwezigheid van ongewenste stoffen) met micro-organismen
• Probleem omwille van hun snelle groei in de rijke groeimilieus
• Bacteriën, schimmels, gisten…
• Moeilijk detecteerbaar
Contaminatie met vreemde cellen
• Het treedt frequenter op dan men beseft
• Detectie van contaminaties is mogelijk door o.a.
genetische fingerprinting of karyotypering
6
