HOOFDSTUK 1: METHODEN EN TECHNIEKEN IN DE HISTOLOGIE
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie (TEM).
Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel
voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
CLM TEM
mbv? mbv zichtbaar licht (fotonen) mbv bundel elektronen
Hoe? - licht valt op object zelf en wordt - elektronen door het preparaat heen
weerkaatst geschoten en opgevangen op een
- doorvallend licht gebruikt gevoelige plaat
Wat? - een cellulaire structuur vergroten - een intracellulaire structuur (inhoud)
- tot grootte van 0,2 Um (lage - een ultra cellulaire structuur (oppervlak)
resolutie: fotonen hebben grotere - tot grootte van 0,1 Um (hoge resolutie:
golflengte) e- hebben kleinere golflengte)
Voorbewerking - Het bewaren van weefsel door - 2 fixaties: met OsO4 en glutaaraldehyde
weefsel? - fixatie (onderdompelen in - staal preparatie (dunne coupes
fixatievloeistof) + ingebed aangemaakt: weefsels ingebed in
in paraffine + aansnijden Epoxyhars)
- invriezen + aansnijden - stalen kleuren: 2e fixatie met OsO4 +
- Het vervaardigen van preparaten geschoten met e-
weefselsneden - donker: veel e- door preparaat
- Het kleuren van weefselsneden → dun preparaat
- licht: linder e- door preparaat →
dik preparaat
Waarom/doel? weefsel bewaren zorgen dat je het weefsel in oorspronkelijke
- geen chemische/structurele staat kan onderzoeken → nadat het van
verandering bloedvoorziening werd afgesloten begint
- geen afbraakprocessen, door osmotische zwelling van mitochondriën en
intrinsieke en externe factoren R/SER
,2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze gebruikt?
FIXATIE
LM verteringsprocessen worden afgeremd waardoor groei MO stopt
- weefsel wordt ondergedompeld in fixatievloeistof (fixator = formol = waterige
oplossing op basis van formaldehyde)
- vorming covalente bindingen met N-terminale groepen van eiwitten (process =
“crosslinking”)
- meeste enzymen verliezen hun enzymatische werking
- Duur varieert van 2h tot 24h: ifv grootte materiaal, gebruikte methode van
fixatie en fixator.
EM goede en snelle fixatie is cruciaal
- fixatie 1: weefsel wordt ondergedompeld in fixatievloeistof (fixator = gekoelde
glutaaraldehyde)
- fixatie 2: osmiumtetroxide OsO4 om vetten te bewaren:
- extra gewicht aan weefsel
- kleurt weefsel zodat het zichtbaar is in EM
- kwaliteit vd fixatie: ifv grootte materiaal, gebruikte methode van fixatie en
fixator.
, 3. Geef de gelijkenissen en verschillen tussen immunohistochemie en immunofluorescentie.
immunohistochemie immunofluorescence
gelijkenissen 2 detectietechnieken (adhv kleuring) om antigenen/epitopen (eiwitten) in weefselcoupes
op te sporen mbv antistoffen/antilichamen
directe 1 staps techniek OF indirecte 2/meerstaps techniek
- primaire antistof met enzym/fluorofoor bindt aan antigen
- secundaire antistof met enzym/fluorofoor bindt aan primaire antistof, bindt aan
antigen
verschillen antistof gebonden aan detectie enzymen met antistof gebonden aan fuorofoor →
kleurloos substraat → bindt aan antigen → bindt aan antigen → indien beschenen
zichtbare kleuromslag met licht van juiste golflengte →
fluorescent licht met bepaalde kleur
uitgestraald
maar 1 antigen kan zichtbaar gemaakt worden verschillende antigenen kunnen
zichtbaar gemaakt worden door
verschillende fluoroforen te gebruiken
die verschillende kleuren uitstralen
, 4. Bespreek directe, indirecte en geampificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
immunohistochemie immunofluorescentie
Directe primaire antistof bevat detectie-enzym en is primaire antistof bevat fluorofoor en is
rechtstreeks gebonden aan antigen rechtstreeks gebonden aan antigen
- snel
- eenvoudig
- weinig signaalversterking (amplificatie)
- indien er weinig antigenen zijn worden ze moeilijker gedetecteerd
WAAROM?
immuunglobuline + complement deposities op sporen in huid en nier
Indirecte secundaire antistof bevat detectie-enzym en secundaire antistof bevat fluorofoor en
bindt aan FC fragment van primaire antistof bindt aan FC fragment van primaire antistof
dat uiteindelijk bindt aan antigen dat uiteindelijk bindt aan antigen
WAAROM?
- flexibeler: secundaire antistof kan hergebruikt worden voor alle organismen van 1
soort → het primaire antistof moet niet steeds gekoppeld worden
- veel signaalversterking
- hoge specificiteit
- goedkoper: minder antistoffen gebruikt
geamplificeerde signaalversterking: bekomen door biotine streptavidine systeem te gebruiken
→ 2 stoffen die zeer sterk met elkaar interageren en grote complexen vormen
→ antistof bevat detectie-enzym/fluorofoor gebonden aan biotine → vormt complex met
streptavidine
WAAROM?
- veel hogere enzymactiviteit
- hogere signaalversterking
Deze methoden bestaan omdat elke methode verschilt in sensitiviteit, specificiteit, affiniteit van de
antistof en beschikbaarheid van de epitopen
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie (TEM).
Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel
voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
CLM TEM
mbv? mbv zichtbaar licht (fotonen) mbv bundel elektronen
Hoe? - licht valt op object zelf en wordt - elektronen door het preparaat heen
weerkaatst geschoten en opgevangen op een
- doorvallend licht gebruikt gevoelige plaat
Wat? - een cellulaire structuur vergroten - een intracellulaire structuur (inhoud)
- tot grootte van 0,2 Um (lage - een ultra cellulaire structuur (oppervlak)
resolutie: fotonen hebben grotere - tot grootte van 0,1 Um (hoge resolutie:
golflengte) e- hebben kleinere golflengte)
Voorbewerking - Het bewaren van weefsel door - 2 fixaties: met OsO4 en glutaaraldehyde
weefsel? - fixatie (onderdompelen in - staal preparatie (dunne coupes
fixatievloeistof) + ingebed aangemaakt: weefsels ingebed in
in paraffine + aansnijden Epoxyhars)
- invriezen + aansnijden - stalen kleuren: 2e fixatie met OsO4 +
- Het vervaardigen van preparaten geschoten met e-
weefselsneden - donker: veel e- door preparaat
- Het kleuren van weefselsneden → dun preparaat
- licht: linder e- door preparaat →
dik preparaat
Waarom/doel? weefsel bewaren zorgen dat je het weefsel in oorspronkelijke
- geen chemische/structurele staat kan onderzoeken → nadat het van
verandering bloedvoorziening werd afgesloten begint
- geen afbraakprocessen, door osmotische zwelling van mitochondriën en
intrinsieke en externe factoren R/SER
,2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze gebruikt?
FIXATIE
LM verteringsprocessen worden afgeremd waardoor groei MO stopt
- weefsel wordt ondergedompeld in fixatievloeistof (fixator = formol = waterige
oplossing op basis van formaldehyde)
- vorming covalente bindingen met N-terminale groepen van eiwitten (process =
“crosslinking”)
- meeste enzymen verliezen hun enzymatische werking
- Duur varieert van 2h tot 24h: ifv grootte materiaal, gebruikte methode van
fixatie en fixator.
EM goede en snelle fixatie is cruciaal
- fixatie 1: weefsel wordt ondergedompeld in fixatievloeistof (fixator = gekoelde
glutaaraldehyde)
- fixatie 2: osmiumtetroxide OsO4 om vetten te bewaren:
- extra gewicht aan weefsel
- kleurt weefsel zodat het zichtbaar is in EM
- kwaliteit vd fixatie: ifv grootte materiaal, gebruikte methode van fixatie en
fixator.
, 3. Geef de gelijkenissen en verschillen tussen immunohistochemie en immunofluorescentie.
immunohistochemie immunofluorescence
gelijkenissen 2 detectietechnieken (adhv kleuring) om antigenen/epitopen (eiwitten) in weefselcoupes
op te sporen mbv antistoffen/antilichamen
directe 1 staps techniek OF indirecte 2/meerstaps techniek
- primaire antistof met enzym/fluorofoor bindt aan antigen
- secundaire antistof met enzym/fluorofoor bindt aan primaire antistof, bindt aan
antigen
verschillen antistof gebonden aan detectie enzymen met antistof gebonden aan fuorofoor →
kleurloos substraat → bindt aan antigen → bindt aan antigen → indien beschenen
zichtbare kleuromslag met licht van juiste golflengte →
fluorescent licht met bepaalde kleur
uitgestraald
maar 1 antigen kan zichtbaar gemaakt worden verschillende antigenen kunnen
zichtbaar gemaakt worden door
verschillende fluoroforen te gebruiken
die verschillende kleuren uitstralen
, 4. Bespreek directe, indirecte en geampificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
immunohistochemie immunofluorescentie
Directe primaire antistof bevat detectie-enzym en is primaire antistof bevat fluorofoor en is
rechtstreeks gebonden aan antigen rechtstreeks gebonden aan antigen
- snel
- eenvoudig
- weinig signaalversterking (amplificatie)
- indien er weinig antigenen zijn worden ze moeilijker gedetecteerd
WAAROM?
immuunglobuline + complement deposities op sporen in huid en nier
Indirecte secundaire antistof bevat detectie-enzym en secundaire antistof bevat fluorofoor en
bindt aan FC fragment van primaire antistof bindt aan FC fragment van primaire antistof
dat uiteindelijk bindt aan antigen dat uiteindelijk bindt aan antigen
WAAROM?
- flexibeler: secundaire antistof kan hergebruikt worden voor alle organismen van 1
soort → het primaire antistof moet niet steeds gekoppeld worden
- veel signaalversterking
- hoge specificiteit
- goedkoper: minder antistoffen gebruikt
geamplificeerde signaalversterking: bekomen door biotine streptavidine systeem te gebruiken
→ 2 stoffen die zeer sterk met elkaar interageren en grote complexen vormen
→ antistof bevat detectie-enzym/fluorofoor gebonden aan biotine → vormt complex met
streptavidine
WAAROM?
- veel hogere enzymactiviteit
- hogere signaalversterking
Deze methoden bestaan omdat elke methode verschilt in sensitiviteit, specificiteit, affiniteit van de
antistof en beschikbaarheid van de epitopen
