Celbiologie
Cytologie =
- Morfologische wetenschap
- Normale structuren cellen en weefsels
= zichtbaar met specifieke kleurtechnieken + detectiemethoden ---> = verband leggen tussen
monoculaire + biomedische kenmerken
Hoofdstuk 1
Celcultuur historisch:
- 3D tissue culture ---> 1e analyseerbaar weefsel = zenuw uit kikkerembryo in lymfe op
glasplaatje
- 2D monolaagcultuur ---> simuleren 3D cultuur = lichaam nabootsen
- Oorspronkelijk = monolaagculturen uit orgaanexplanten (= primaire cultuur) in EMEM (=
earle’s minimum essential medium)
---> later = stabiele lijnen maken met onbeperkte levensduur (= v tumorale oorsprong) --->
crisis = afsterven
Stadia cel cultivering:
1. Weefsel enzymatisch behandelen (= losmaken)
2. Cellen = nr boden centrifugeren
3. Cellen = uitgeplaat in groeirecipient (bv petridish)
4. Cellen groeien uit
5. Volledige laag = cellen losmaken en splitsen ---> verdelen over andere recipiënt
---> situatie in vivo nabootsen = cellen hebben ondergrond nodig om op te groeien
---> recipiënten: - gesloten flessen (CO2 toevoegen voor sluiting
- open platen
- rollerflessen = groot opp + weinig medium
- CO2 oven met platen
Type celculturen:
- Monocultuur = 1 laag
- Kolonies op elkaar ---> bv tumorcellen
Cultuur condities:
Bv. MEM (minimum essential medium) = atmoseef v 5% CO2 ---> zo goede pH bereiken (7,6 = bloed)
1
,Groeisubstraten:
= beschermt tg anoïkis (= vorm van apoptose ---> = geen ondergrond meer) ---> essentieel +
proberen in vivo situaties na te bootsen
+ cellen = stoffen/signalen v omliggende cellen nodig = nabootsen dr:
- Medium v moedercultuur gebruiken
- Cellen op feeder collaag te groeien (dr verschillende coatings)
Doel:
- Aspecifieke fysische interacties = toelaten cellulaire adhesie + cel spreiding
- Specifieke adhesie = functionele interactie met onderliggende cellen (bv. Andere cellen of
basaal membraan)
Oorsprong cellijnen:
Cellen afkomstig van:
- Andere laboratoria
- Eigen isolatie (= primaire celculturen)
- Celbanken:
- ATCC = amerika
- ECACC = europa
Procedure v cel transfer:
---> dr eenvoudige verdunning bij suspensiecultures (= op monolaag)
Bij adherente cellen = bij confluentie v cellaag ---> behandelen met:
- Trypsine: maagprotease ---> opp-eiwitten v cellen degraderen
- EDTA: cheleert Ca + Mg ---> interfereert met intercellulaire adhesie + cel-substraat-binding
---> cellen komen los v substraat + van elkaar ---> vormen suspensie v cellen = optimaal monocellulair
---> 1/3 (= normale cellen) + 1/30 (= tumorcellen) overbrengen nr nieuwe cultuur
---> resterende trypsine = inhiberen
Bv. 1 over 3 met 10 ml cellen = 3,33 ml
overbrengen nr nieuwe celcultuur
---> celculturen lang bewaren = in vloeibaar stikstof
---> steriele omgeving = laminaire flowbench
2
,Stappen bij celadhesie en -spreiding:
= na losmaken + uitplaten vd cellen:
1. Zakken o.i.v Fz
2. Initieel contact met substraat (cellen = nog opgebold = min opp)
3. Proces van progressieve spreiding over substraat (= vraagt E + cytoskeletwijziging --->
vergroten celopp + versterking cel-substraatadhesie)
4. Sterk binden aan subst met eigen ECM moleculen
---> cel kan nog steeds traag migreren over celoppervlak = tijdelijke inhibitie v adhesie + ergens
anders opbouwen
Stamcel:
= cel die vermogen heeft zich voortdurend te delen +
differentiëren in verschillende soorten weefsels + cellen
Totipotent =
- Vermogen tot zelfvernieuwing = zichzelf delen + kopiëren
- Vermogen tot differentiëren = ontstaan volwassen celtypen ---> vormen organen + weefsels
---> in eerste uren na bevruchting = eicel delen in 2 ---> 1 of beide = potentieel om foetus te worden
Pluripotent =
140 totipotente cellen = blastocyt = holle bal met binnenste laag = binnenste celmassa ---> naar
baarmoeder ---> buitenste = placenta + binnenste = foetus ---> = pluripotent want kan geen volledig
organisme uit groeien (want geen placenta) maar wel veel andere celtypes
Multipotent =
Individuele cellen binnen binnenste celmassa + worden gespecialiseerd naar mate van plaats van
voorkomen ---> bv. Hemopoëtische cellen = kunnen ontwikkelen tot verschillende soorten
gespecialiseerde cellen
Celcultuur bij muizen =
Embryonale cellen nemen uit muis (= isoleren) ---> in cultuur brengen = dubbel cultuur ( = stamcellen
hebben veel info nodig + veel componenten ---> laag met virus maken = bevat eiwitten = dubbele
laag) = zorgt voor blijven van stamcellen
===> kan volledig nieuwe muis maken (= pluripotente stamcellen)
3
, Humane embryonale stamcellen =
Uit embryo’s halen + in cultuur brengen ---> lukt niet om volledig nieuw embryo te maken ---> wel
allerlei andere organen ---> zo humane ontwikkeling volgen tot 12 dagen oud
---> geïnduceerde pluripotente stamcellen: (iPSCs)
= cel isoleren ---> in cultuur nemen ---> met mix v eiwitten
pluripotente stamcellen maken ===> alle mogelijke cellen
maken/ verkeerd-werkende cellen aanpassen---> cellen
terugbrengen nr patiënt
Bv. Gezonde organen maken
kwaliteitscontrole:
- Contaminatie met micro-organismen:
Probleem dr snelle groei + rijke groei milieus ---> veel bacteriën + gisten + schimmels +
antibiotica-resistente plasma’s omvatten ---> parasitair = verstoren cellulair metabolisme +
moeilijk detecteerbaar + elimineerbaar
- Contaminatie met vreemde cellen:
---> bv HeLa = in erg veel celculturen gekropen + afkomstig van muis/rat ---> detectie =
fingerprinting + karyotypering
Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit:
= gemeten worden dr karyotypering = aantal chromosomen bepalen
---> Instabiliteit =
Genotype = van kwaad nr erger bv. Te veel/weinig chromosomen
---> niet te vermijden maar beperken dr terug gaan nr stock-cultures = ingevroren in
vloeibaar stikstof
Prepareren en observeren v cellen + weefsel
Doel =
Cellen + weefsels observeerbaar maken voor EM en LM ---> te weinig licht/elektron doorlatend +
weinig contrast met bio materiaal door dikte v materiaal
---> methodes:
- Fixeren Kleuren + contrasteren
- Inbedden + snijden
4
Cytologie =
- Morfologische wetenschap
- Normale structuren cellen en weefsels
= zichtbaar met specifieke kleurtechnieken + detectiemethoden ---> = verband leggen tussen
monoculaire + biomedische kenmerken
Hoofdstuk 1
Celcultuur historisch:
- 3D tissue culture ---> 1e analyseerbaar weefsel = zenuw uit kikkerembryo in lymfe op
glasplaatje
- 2D monolaagcultuur ---> simuleren 3D cultuur = lichaam nabootsen
- Oorspronkelijk = monolaagculturen uit orgaanexplanten (= primaire cultuur) in EMEM (=
earle’s minimum essential medium)
---> later = stabiele lijnen maken met onbeperkte levensduur (= v tumorale oorsprong) --->
crisis = afsterven
Stadia cel cultivering:
1. Weefsel enzymatisch behandelen (= losmaken)
2. Cellen = nr boden centrifugeren
3. Cellen = uitgeplaat in groeirecipient (bv petridish)
4. Cellen groeien uit
5. Volledige laag = cellen losmaken en splitsen ---> verdelen over andere recipiënt
---> situatie in vivo nabootsen = cellen hebben ondergrond nodig om op te groeien
---> recipiënten: - gesloten flessen (CO2 toevoegen voor sluiting
- open platen
- rollerflessen = groot opp + weinig medium
- CO2 oven met platen
Type celculturen:
- Monocultuur = 1 laag
- Kolonies op elkaar ---> bv tumorcellen
Cultuur condities:
Bv. MEM (minimum essential medium) = atmoseef v 5% CO2 ---> zo goede pH bereiken (7,6 = bloed)
1
,Groeisubstraten:
= beschermt tg anoïkis (= vorm van apoptose ---> = geen ondergrond meer) ---> essentieel +
proberen in vivo situaties na te bootsen
+ cellen = stoffen/signalen v omliggende cellen nodig = nabootsen dr:
- Medium v moedercultuur gebruiken
- Cellen op feeder collaag te groeien (dr verschillende coatings)
Doel:
- Aspecifieke fysische interacties = toelaten cellulaire adhesie + cel spreiding
- Specifieke adhesie = functionele interactie met onderliggende cellen (bv. Andere cellen of
basaal membraan)
Oorsprong cellijnen:
Cellen afkomstig van:
- Andere laboratoria
- Eigen isolatie (= primaire celculturen)
- Celbanken:
- ATCC = amerika
- ECACC = europa
Procedure v cel transfer:
---> dr eenvoudige verdunning bij suspensiecultures (= op monolaag)
Bij adherente cellen = bij confluentie v cellaag ---> behandelen met:
- Trypsine: maagprotease ---> opp-eiwitten v cellen degraderen
- EDTA: cheleert Ca + Mg ---> interfereert met intercellulaire adhesie + cel-substraat-binding
---> cellen komen los v substraat + van elkaar ---> vormen suspensie v cellen = optimaal monocellulair
---> 1/3 (= normale cellen) + 1/30 (= tumorcellen) overbrengen nr nieuwe cultuur
---> resterende trypsine = inhiberen
Bv. 1 over 3 met 10 ml cellen = 3,33 ml
overbrengen nr nieuwe celcultuur
---> celculturen lang bewaren = in vloeibaar stikstof
---> steriele omgeving = laminaire flowbench
2
,Stappen bij celadhesie en -spreiding:
= na losmaken + uitplaten vd cellen:
1. Zakken o.i.v Fz
2. Initieel contact met substraat (cellen = nog opgebold = min opp)
3. Proces van progressieve spreiding over substraat (= vraagt E + cytoskeletwijziging --->
vergroten celopp + versterking cel-substraatadhesie)
4. Sterk binden aan subst met eigen ECM moleculen
---> cel kan nog steeds traag migreren over celoppervlak = tijdelijke inhibitie v adhesie + ergens
anders opbouwen
Stamcel:
= cel die vermogen heeft zich voortdurend te delen +
differentiëren in verschillende soorten weefsels + cellen
Totipotent =
- Vermogen tot zelfvernieuwing = zichzelf delen + kopiëren
- Vermogen tot differentiëren = ontstaan volwassen celtypen ---> vormen organen + weefsels
---> in eerste uren na bevruchting = eicel delen in 2 ---> 1 of beide = potentieel om foetus te worden
Pluripotent =
140 totipotente cellen = blastocyt = holle bal met binnenste laag = binnenste celmassa ---> naar
baarmoeder ---> buitenste = placenta + binnenste = foetus ---> = pluripotent want kan geen volledig
organisme uit groeien (want geen placenta) maar wel veel andere celtypes
Multipotent =
Individuele cellen binnen binnenste celmassa + worden gespecialiseerd naar mate van plaats van
voorkomen ---> bv. Hemopoëtische cellen = kunnen ontwikkelen tot verschillende soorten
gespecialiseerde cellen
Celcultuur bij muizen =
Embryonale cellen nemen uit muis (= isoleren) ---> in cultuur brengen = dubbel cultuur ( = stamcellen
hebben veel info nodig + veel componenten ---> laag met virus maken = bevat eiwitten = dubbele
laag) = zorgt voor blijven van stamcellen
===> kan volledig nieuwe muis maken (= pluripotente stamcellen)
3
, Humane embryonale stamcellen =
Uit embryo’s halen + in cultuur brengen ---> lukt niet om volledig nieuw embryo te maken ---> wel
allerlei andere organen ---> zo humane ontwikkeling volgen tot 12 dagen oud
---> geïnduceerde pluripotente stamcellen: (iPSCs)
= cel isoleren ---> in cultuur nemen ---> met mix v eiwitten
pluripotente stamcellen maken ===> alle mogelijke cellen
maken/ verkeerd-werkende cellen aanpassen---> cellen
terugbrengen nr patiënt
Bv. Gezonde organen maken
kwaliteitscontrole:
- Contaminatie met micro-organismen:
Probleem dr snelle groei + rijke groei milieus ---> veel bacteriën + gisten + schimmels +
antibiotica-resistente plasma’s omvatten ---> parasitair = verstoren cellulair metabolisme +
moeilijk detecteerbaar + elimineerbaar
- Contaminatie met vreemde cellen:
---> bv HeLa = in erg veel celculturen gekropen + afkomstig van muis/rat ---> detectie =
fingerprinting + karyotypering
Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit:
= gemeten worden dr karyotypering = aantal chromosomen bepalen
---> Instabiliteit =
Genotype = van kwaad nr erger bv. Te veel/weinig chromosomen
---> niet te vermijden maar beperken dr terug gaan nr stock-cultures = ingevroren in
vloeibaar stikstof
Prepareren en observeren v cellen + weefsel
Doel =
Cellen + weefsels observeerbaar maken voor EM en LM ---> te weinig licht/elektron doorlatend +
weinig contrast met bio materiaal door dikte v materiaal
---> methodes:
- Fixeren Kleuren + contrasteren
- Inbedden + snijden
4
