0
SPECTROSCOPY OF
BIOMOLECULES
Samenvatting
Abstract
Dit document biedt gedetailleerde informatie en begeleiding om studenten
uit te rusten met de vaardigheden die nodig zijn voor geavanceerde
biomoleculaire structuurverheldering m.b.v. geavanceerde spectroscopische
technieken. Door het begrijpen en uitleggen v/d principes van
spectroscopische technieken, en door middel van praktische voorbeelden,
zullen studenten leren hoe ze deze methoden effectief kunnen gebruiken
voor structurele analyse.
Bovendien behandelt het de verschijnselen van stationaire en tijdsopgeloste
fluorescentie en fluorescentieanisotropie, waarbij studenten leren deze
methoden toe te passen voor het bestuderen van moleculaire interacties. De
principes van circulaire dichroïsme worden uitgelegd, evenals de toepassing
ervan bij het analyseren van secundaire structuren in biomoleculen. Ten
slotte bevat het document inzichten in het analyseren van Ramanverstrooiing
en het toepassen v/dze techniek om moleculen in oplossing te bestuderen.
Cara Mestdag
KU LEUVEN
, 1
Inhoud
Introduction: The electromagnetic spectrum and different types of spectroscopy.....................3
Atoomspectroscopie............................................................................................................... 4
Spectroscopie v/h waterstofatoom...................................................................................... 4
Foto-elektrisch effect van Einstein...................................................................................... 5
Atoommodel van Bohr......................................................................................................... 6
Golfmechanische behandeling v/h atoom: de SCHRODINGER-vergelijking........................10
Hogere atomen in het periodiek systeem..........................................................................11
Relatie orbitalen en lijnenspectrum................................................................................... 12
Moleculaire spectra............................................................................................................... 13
Chromoforen...................................................................................................................... 14
Elektron-in-de-doos model................................................................................................. 15
De Wet van Lambert Beer................................................................................................. 16
Meten van absorptiespectra met de spectrofotometer.........................................................17
Raman spectroscopy................................................................................................................ 18
Raman scattering: classical picture...................................................................................... 18
The Raman effect: inelastic scattering.................................................................................. 19
Raman scattering intensity and shift.................................................................................... 20
Voordelen, nadelen,…........................................................................................................... 21
Infrared Spectrscopy................................................................................................................ 23
Interpreting IR spectra.......................................................................................................... 25
Identification of substances............................................................................................... 25
Determination of molecular structure............................................................................... 27
Quantitative measurements.............................................................................................. 27
Detection of impurities (quality control in industry)..........................................................28
Biological applications....................................................................................................... 28
Examenvraag........................................................................................................................ 29
Fluorescense............................................................................................................................ 31
Absorptie en emmisie spectra.............................................................................................. 32
Het energiediagram van Franck-Condon........................................................................... 32
Jablonski diagram.............................................................................................................. 32
De symmetrische aard van spectra................................................................................... 33
Stokes shift........................................................................................................................ 33
Chromoforen en fluoforen..................................................................................................... 35
Het meten van fluorescentie................................................................................................. 35
Fluorescentie quantum yield en fluorescentie levensduur....................................................36
, 2
Time-resolved emission spectroscopy.................................................................................. 38
Excimers, eciplex, aggegates............................................................................................... 38
Ex-examenvraag................................................................................................................... 38
Quenching processes in fluorescence: collisional quenching an energy (electron)transfer. .39
Energy transfer.................................................................................................................. 40
FRET.................................................................................................................................. 41
Fluorescence anisotrophy and polarization...........................................................................42
Experimental determination of anisotropy........................................................................43
Derivation of equations..................................................................................................... 45
De complicatie die ontstaat wanneer moleculen een hoek α hebben tussen de excitatie-
en emissiemomenten, kan worden behandeld op een manier die vergelijkbaar is met de
behandeling van de hoek θ. Dit houdt in dat de probabiliteitsdistributie en
integratiefactoren hetzelfde blijven, waardoor de algemene aanpak voor het berekenen
van anisotropie behouden blijft......................................................................................... 45
Causes of depolarisation................................................................................................... 46
Time resolved anisotropy.................................................................................................. 46
Complex anisotropy decays............................................................................................... 47
Circular Dichroism Spectroscoy................................................................................................ 48
Moleculaire basis.................................................................................................................. 49
Toepassingen........................................................................................................................ 49
Sample preparation.............................................................................................................. 50
, 3
Introduction: The electromagnetic spectrum and
different types of spectroscopy
Spectroscopie is de wetenschap die zich bezighoudt met de karakterisering v/d interactie
tussen elektromagnetische straling (licht) en materie, waarbij absorptie of emissie van licht
centraal staat. Deze wetenschap analyseert de emissiespectra van atomen, moleculen, en
materialen. Spectrofotometrie, een tak binnen de spectroscopie, richt zich specifiek op het
meten v/d absorptie van licht in functie v/d golflengte v/h aangeboden licht, wat resulteert in
het opzetten van een absorptiespectrum. Dit spectrum kan worden gebruikt voor
identificatie&kwantificering van stoffen, als verschijnselen specifiek zijn voor een
bepaalde stof.
de omgeving waarin de stof zich bevindt te achterhalen, bijvoorbeeld in een
membraan, in een homogene polaire of niet-polaire oplossing, of in een niet-homogene
omgeving
de oriëntatie en beweging van moleculen te bepalen, en kan door deze beweging de
grootte v/d moleculen worden bepaald
specifieke moleculaire interacties te analyseren
Door gebruik te maken van microscopen kan deze techniek zelfs worden toegepast binnen
levende cellen. Meestal is het een niet-destructieve onderzoeksmethode.
Naargelang de energie-inhoud v/d elektromagnetische straling (frequentie) verschilt de aard
v/h fenomeen dat verantwoordelijk is voor de energie-absorptie. Ook verschillen de
technieken die nodig zijn om deze energie-absorptie vast te stellen. Vandaar dat er
afzonderlijke domeinen van spectroscopie bestaan:
Naam Golflengte van geabsorbeerde Fenomeen
straling
UltraViolet- Far UC of vacuum UV: 100-200nm Elektronen bewegen naar een
zichtbaar licht: Near UV: 200-400nm hoger energielevel (orbitaal) =
UV-VIS VIS: 400-800nm ELEKTRONISCHE TRANSITIONS
Infrarood: IR 800nm-100µm Vibraties v. bindingen tussen
atomen
Microwave 100µm-10cm Rotaties van bindingen
region
Radiogolven >cm, m Veranderingen in spin states v.
atomen
In het zichtbaar licht spectrum onderscheiden we verschillende kleuren. De kleur van
doorgelaten licht wordt bepaald door het golflengtegebied v/d absorptie (= complementaire
kleur): rood (620-700nm), oranje (580-620nm), geel (560-580nm), groen (490-560nm), blauw
(430-490nm) en violet (380-430nm).
Stoffen die zichtbaar licht absorberen noemen we kleurstoffen. Zij kunnen ook gehecht
worden aan andere moleculen om ze op deze manier zichtbaar en meetbaar te maken.
SPECTROSCOPY OF
BIOMOLECULES
Samenvatting
Abstract
Dit document biedt gedetailleerde informatie en begeleiding om studenten
uit te rusten met de vaardigheden die nodig zijn voor geavanceerde
biomoleculaire structuurverheldering m.b.v. geavanceerde spectroscopische
technieken. Door het begrijpen en uitleggen v/d principes van
spectroscopische technieken, en door middel van praktische voorbeelden,
zullen studenten leren hoe ze deze methoden effectief kunnen gebruiken
voor structurele analyse.
Bovendien behandelt het de verschijnselen van stationaire en tijdsopgeloste
fluorescentie en fluorescentieanisotropie, waarbij studenten leren deze
methoden toe te passen voor het bestuderen van moleculaire interacties. De
principes van circulaire dichroïsme worden uitgelegd, evenals de toepassing
ervan bij het analyseren van secundaire structuren in biomoleculen. Ten
slotte bevat het document inzichten in het analyseren van Ramanverstrooiing
en het toepassen v/dze techniek om moleculen in oplossing te bestuderen.
Cara Mestdag
KU LEUVEN
, 1
Inhoud
Introduction: The electromagnetic spectrum and different types of spectroscopy.....................3
Atoomspectroscopie............................................................................................................... 4
Spectroscopie v/h waterstofatoom...................................................................................... 4
Foto-elektrisch effect van Einstein...................................................................................... 5
Atoommodel van Bohr......................................................................................................... 6
Golfmechanische behandeling v/h atoom: de SCHRODINGER-vergelijking........................10
Hogere atomen in het periodiek systeem..........................................................................11
Relatie orbitalen en lijnenspectrum................................................................................... 12
Moleculaire spectra............................................................................................................... 13
Chromoforen...................................................................................................................... 14
Elektron-in-de-doos model................................................................................................. 15
De Wet van Lambert Beer................................................................................................. 16
Meten van absorptiespectra met de spectrofotometer.........................................................17
Raman spectroscopy................................................................................................................ 18
Raman scattering: classical picture...................................................................................... 18
The Raman effect: inelastic scattering.................................................................................. 19
Raman scattering intensity and shift.................................................................................... 20
Voordelen, nadelen,…........................................................................................................... 21
Infrared Spectrscopy................................................................................................................ 23
Interpreting IR spectra.......................................................................................................... 25
Identification of substances............................................................................................... 25
Determination of molecular structure............................................................................... 27
Quantitative measurements.............................................................................................. 27
Detection of impurities (quality control in industry)..........................................................28
Biological applications....................................................................................................... 28
Examenvraag........................................................................................................................ 29
Fluorescense............................................................................................................................ 31
Absorptie en emmisie spectra.............................................................................................. 32
Het energiediagram van Franck-Condon........................................................................... 32
Jablonski diagram.............................................................................................................. 32
De symmetrische aard van spectra................................................................................... 33
Stokes shift........................................................................................................................ 33
Chromoforen en fluoforen..................................................................................................... 35
Het meten van fluorescentie................................................................................................. 35
Fluorescentie quantum yield en fluorescentie levensduur....................................................36
, 2
Time-resolved emission spectroscopy.................................................................................. 38
Excimers, eciplex, aggegates............................................................................................... 38
Ex-examenvraag................................................................................................................... 38
Quenching processes in fluorescence: collisional quenching an energy (electron)transfer. .39
Energy transfer.................................................................................................................. 40
FRET.................................................................................................................................. 41
Fluorescence anisotrophy and polarization...........................................................................42
Experimental determination of anisotropy........................................................................43
Derivation of equations..................................................................................................... 45
De complicatie die ontstaat wanneer moleculen een hoek α hebben tussen de excitatie-
en emissiemomenten, kan worden behandeld op een manier die vergelijkbaar is met de
behandeling van de hoek θ. Dit houdt in dat de probabiliteitsdistributie en
integratiefactoren hetzelfde blijven, waardoor de algemene aanpak voor het berekenen
van anisotropie behouden blijft......................................................................................... 45
Causes of depolarisation................................................................................................... 46
Time resolved anisotropy.................................................................................................. 46
Complex anisotropy decays............................................................................................... 47
Circular Dichroism Spectroscoy................................................................................................ 48
Moleculaire basis.................................................................................................................. 49
Toepassingen........................................................................................................................ 49
Sample preparation.............................................................................................................. 50
, 3
Introduction: The electromagnetic spectrum and
different types of spectroscopy
Spectroscopie is de wetenschap die zich bezighoudt met de karakterisering v/d interactie
tussen elektromagnetische straling (licht) en materie, waarbij absorptie of emissie van licht
centraal staat. Deze wetenschap analyseert de emissiespectra van atomen, moleculen, en
materialen. Spectrofotometrie, een tak binnen de spectroscopie, richt zich specifiek op het
meten v/d absorptie van licht in functie v/d golflengte v/h aangeboden licht, wat resulteert in
het opzetten van een absorptiespectrum. Dit spectrum kan worden gebruikt voor
identificatie&kwantificering van stoffen, als verschijnselen specifiek zijn voor een
bepaalde stof.
de omgeving waarin de stof zich bevindt te achterhalen, bijvoorbeeld in een
membraan, in een homogene polaire of niet-polaire oplossing, of in een niet-homogene
omgeving
de oriëntatie en beweging van moleculen te bepalen, en kan door deze beweging de
grootte v/d moleculen worden bepaald
specifieke moleculaire interacties te analyseren
Door gebruik te maken van microscopen kan deze techniek zelfs worden toegepast binnen
levende cellen. Meestal is het een niet-destructieve onderzoeksmethode.
Naargelang de energie-inhoud v/d elektromagnetische straling (frequentie) verschilt de aard
v/h fenomeen dat verantwoordelijk is voor de energie-absorptie. Ook verschillen de
technieken die nodig zijn om deze energie-absorptie vast te stellen. Vandaar dat er
afzonderlijke domeinen van spectroscopie bestaan:
Naam Golflengte van geabsorbeerde Fenomeen
straling
UltraViolet- Far UC of vacuum UV: 100-200nm Elektronen bewegen naar een
zichtbaar licht: Near UV: 200-400nm hoger energielevel (orbitaal) =
UV-VIS VIS: 400-800nm ELEKTRONISCHE TRANSITIONS
Infrarood: IR 800nm-100µm Vibraties v. bindingen tussen
atomen
Microwave 100µm-10cm Rotaties van bindingen
region
Radiogolven >cm, m Veranderingen in spin states v.
atomen
In het zichtbaar licht spectrum onderscheiden we verschillende kleuren. De kleur van
doorgelaten licht wordt bepaald door het golflengtegebied v/d absorptie (= complementaire
kleur): rood (620-700nm), oranje (580-620nm), geel (560-580nm), groen (490-560nm), blauw
(430-490nm) en violet (380-430nm).
Stoffen die zichtbaar licht absorberen noemen we kleurstoffen. Zij kunnen ook gehecht
worden aan andere moleculen om ze op deze manier zichtbaar en meetbaar te maken.
