Hoofdstuk 3: RNA
Verschil DNA en RNA:
- RNA heeft uracyl en DNA heeft thymine
- DNA is evolutionair het oudste er bestond DNA dat uracyl bevatte en dat is dan
naar thymine verandert, wat het stabieler maakt tegen mutaties
- DNA heeft deoxyribonucleic acid en RNA heeft ribonucleic ribose (hydroxygroep op 2’
zorgt voor minder stabiliteit)
- Dideoxynucleic acid: Sangersequentie
- DNA is vaak dubbelstrengig en RNA is vaak enkelstrengig + kan 3D structuur hebben
Soorten RNA:
- Paradigma: DNA RNA eiwitten
- rRNA: 95% van alle RNA is rRNA
- tRNA: translatie van RNA naar eiwitten
- mRNA: 1-4% boodschapper RNA, vertaal van DNA naar eiwitten
- Korte, niet-coderende RNA: rol bij ziekte en helpen transcriptie te reguleren,
genexpressie reguleren
- Lange, niet coderende RNA
- Small interfering RNA: cellen moduleren
Structuur mRNA:
- Pre-mRNA: intronen eruit geknipt tot matuur mRNA
- Coderende regio
- 5’ en 3’ UTR: untranslated region niet omgezet naar eiwitten
- 5’ cap en 3’ poly A staart
1. RNA voorzorgen en bewaren
Mogelijke problemen:
- RNA profiel verandert na staalafname, bv. inductie genen
- RNA degradatie door endogene (in staal) of exogene (van buitenaf) RNAasen
- DNA contaminatie: scheiding DNA /RNA is meestal onvolledig
Staalname:
- Keuze anticoagulans: best EDTA, heparine inhibeert DNA/RNA reacties
- RNA stabilisatie: RNA degradatie en/of inductie voorkomen
- Onmiddellijk verwerken of invriezen in vloeibare stikstof (-196°C)
- Totaal bloed: vacuümtube met RNA bewaarmiddel, bv. PAXgene tube
- Cellen/weefsel: RNA bewaarmiddel, bv. RNAlater (Ammoniumsulfaat
oplossing precipiteert eiwitten, verwijderen voor
extractie) of Trizol (al 1e stap van extractie)
1
,Staalverwerking: RNAse-vrij werken
- Zeer zuiver werken
- Labojas en handschoenen om stalen te beschermen
- Afgebakende labo-bench zone voor RNA werk
- Oppervlakten, pipetten, …: RNAse schoonmaakproduct, bv. RNAseZAP
- RNAse vrije filter-pipettips en plastics
- Nuclease-vrije oplossingen/water:
- Gefilterd water (Milli Q), RT-PCR grade water (getest op RNAsen)
- Behandeling met RNAse inhibitoren
- DEPC: reageert met amines in AZ in de katalytische site van RNAsen
en inhibeert die
- Nieuwere RNAse inhibitoren (minder carcinogeen)
Bewaring:
- RNAse-vrij water (of TE-buffer 10/1, maar EDTA inhibeert RNAse niet, itt. DNAsen)
- Bewaring tot 1 jaar op -80°C (minder lang dan DNA)
- Langere bewaring eventueel als alcoholprecipitaat
- Beter: meerdere aliquots staal in RNA bewaarmiddel voor latere RNA extractie
bewaren
DNA contaminatie:
- Niet altijd probleem, bv. niet wanneer toepassing onderscheid maakt tussen
DNA/RNA
- Detecteren: RT min controle, elektroforese
- Verwijderen: DNAse behandeling
- Toevoegen tijdens RNA extractie of behandeling van al geëxtraheerd RNA
- DNAsel (knipt dsDNA en ssDNA) of dsDNA-specifieke DNAsen
- Inactivatie (hitte) of verwijdering DNAse na behandeling
- Nadeel: verlies of degradatie van RNA mogelijk
2. RNA extraheren
Methode:
- Afhankelijk van startmateriaal (weefsel, bloed, bacteriecultuur, virussen)
- Afhankelijk van doel (hoeveelheid, kwaliteit)
Stappen:
- Lyseren: weefsel/cellen afbreken zodat RNA vrijkomt, lysaat = vloeistof met inhoud
van gelyseerde cellen, goede homogenisatie belangrijk
- Isoleren: RNA uit lysaat halen of opzuiveren (zonder eiwitten, eventueel zonder DNA)
- Oplossen: RNA in gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen, daarbij
concentreren
2
,Afbraak, lysis en homogenisatie van weefsels/cellen:
- Stap in extractie van DNA, RNA en eiwitten er bestaan verschillende methoden
- Vaak toevoeging van remmers van niet-gewenste moleculen, bv. DNAsen, RNAsen,
proteasen
- Detergenten, bv. SDS, Trizol, guanidium chloride (meest gebruikt)
- Vriezen en ontdooien (lyseert, cryopreservatie om cellen intact te houden)
- Mechanische homogenisatie: pletten in vloeibare stikstof tot poeder in mortier met
pestel, bead-gebaseerde homogenisator + schudden
aan hoge snelheid
- Vloeibare homogenisatie: dounce homogenisator of Douncer (oplossing tussen
glazen pestels) voordeel: mild, laat celfracties
(organellen) intact
- Sonicatie (geluidsgolven): gebruikt voor gewenste DNA fragmentatie, nadeel is dat
het ook DNA/RNA kan fragmenteren
2.1. RNA extractie met organische solventen (Trizol)
Trizol: acid (pH = 4,5) guanidium thiocyanaat – fenol – chloroform
Guanidium thiocyanaar: cellysis + RNAse inhibitor
Toevoegen, goed mengen, RNA (in waterlaag) nu gescheiden van DNA en eiwitten (in
organische laag + interfase = tussen 2 lagen)
Voordeel: eenvoudig, goedkoop, zeer goede opbrengst en zuiverheid
Waterlaag (met RNA) overbrengen naar nieuwe tube
Gevolgd door alcoholprecipitatie van RNA uit waterlaag of kolomchromatografie
Vergelijk met DNA extractie:
- Phenol – chloroform pH 7 voor DNA extractie en Trizol pH 4,5 voor RNA extractie
- Verschil in pH en lading DNA/RNA zorgt voor scheiding RNA in waterlaag en DNA in
waterlaag of organische laag/interfase
- Combinatie-methode: verder werken met beide lagen (voor DNA en RNA extractie)
2.2. Alcoholprecipitatie
Alcoholprecipitatie uit supernatans idem zoals voor DNA alcoholprecipitatie
Principe: DNA + RNA precipiteert in aanwezigheid van zout (bv. Na) + alcohol, DNA en RNA
lost terug op in water/buffer
Zouten: Natriumacetaat (andere voor specifieke toepassingen)
Alcoholen: ethanol of isopropanol
3
, 2.3. Kolomchromatografie
Principe:
- Silica kolom idem als bij DNA extractie
- Bepaalde condities van zout + pH: selectieve binding van RNA (DNA meestal niet
100% verwijderd)
- Andere condities zetten RNA terug vrij (elutie)
Vloeistof gaat door kolom op basis van: centrifugeren, zwaartekracht of vacuüm
Verschillende types kolom commercieel beschikbaar, bv. Qiagen:
- Voordeel: eenvoudig, zeer goede zuiverheid
- Nadeel: duurder, opbrengst beperkt door capaciteit van de kolommetjes
Automatisering: magnetische beads met silica toevoegen, met magneet beads uit oplossing
halen
Silica kolom:
- Buffer met chaotrope zouten (bv. guanidium chloride) lysis, nuclease inhibitie,
chaotroop zout zorgt voor selectieve binding van RNA aan silica kolom
- Spin kolom: vloeistof door kolom sturen door centrifugeren
- Elutie (losmaken): water/buffer zet RNA terug vrij
- Automatisering: magnetische beads met silica toevoegen, met magneet uit oplossing
halen bedoeling: grote schaal, high-throughput, automatisering
met robots Bv. Covid-19 diagnostische testen
3. RNA kwantificeren
Waarom:
- Inschatting opbrengst (extractie goed gelukt?), welke hoeveelheid is beschikbaar
voor experimenten
- Verschillende toepassingen vragen bepaalde concentratie/hoeveelheid RNA als input
- Afwijkende concentraties/hoeveelheden kunnen hinderen te laag: onvoldoende
input voor experiment, vooral voor weinig abundantie targets te hoog: mogelijk
inhibitie of saturatie (bv. ddPCR), meer is niet altijd beter
- Kwantificatiemethoden vergelijkbaar met DNA, maar met een aantal verschillen
Spectrofotometrie (UV/zichtbaar licht):
- Principe: absorptie van licht door RNA in oplossing
- Voordeel: snel, eenvoudig, concentratie + zuiverheid (eiwit, organische solventen)
- Nadeel: aspecifiek (absorptie door alle aanwezige moleculen), overschat
concentratie, geen onderscheid DNA-RNA (DNA contaminatie van RNA)
- Toepassing: ng/µl range
4
Verschil DNA en RNA:
- RNA heeft uracyl en DNA heeft thymine
- DNA is evolutionair het oudste er bestond DNA dat uracyl bevatte en dat is dan
naar thymine verandert, wat het stabieler maakt tegen mutaties
- DNA heeft deoxyribonucleic acid en RNA heeft ribonucleic ribose (hydroxygroep op 2’
zorgt voor minder stabiliteit)
- Dideoxynucleic acid: Sangersequentie
- DNA is vaak dubbelstrengig en RNA is vaak enkelstrengig + kan 3D structuur hebben
Soorten RNA:
- Paradigma: DNA RNA eiwitten
- rRNA: 95% van alle RNA is rRNA
- tRNA: translatie van RNA naar eiwitten
- mRNA: 1-4% boodschapper RNA, vertaal van DNA naar eiwitten
- Korte, niet-coderende RNA: rol bij ziekte en helpen transcriptie te reguleren,
genexpressie reguleren
- Lange, niet coderende RNA
- Small interfering RNA: cellen moduleren
Structuur mRNA:
- Pre-mRNA: intronen eruit geknipt tot matuur mRNA
- Coderende regio
- 5’ en 3’ UTR: untranslated region niet omgezet naar eiwitten
- 5’ cap en 3’ poly A staart
1. RNA voorzorgen en bewaren
Mogelijke problemen:
- RNA profiel verandert na staalafname, bv. inductie genen
- RNA degradatie door endogene (in staal) of exogene (van buitenaf) RNAasen
- DNA contaminatie: scheiding DNA /RNA is meestal onvolledig
Staalname:
- Keuze anticoagulans: best EDTA, heparine inhibeert DNA/RNA reacties
- RNA stabilisatie: RNA degradatie en/of inductie voorkomen
- Onmiddellijk verwerken of invriezen in vloeibare stikstof (-196°C)
- Totaal bloed: vacuümtube met RNA bewaarmiddel, bv. PAXgene tube
- Cellen/weefsel: RNA bewaarmiddel, bv. RNAlater (Ammoniumsulfaat
oplossing precipiteert eiwitten, verwijderen voor
extractie) of Trizol (al 1e stap van extractie)
1
,Staalverwerking: RNAse-vrij werken
- Zeer zuiver werken
- Labojas en handschoenen om stalen te beschermen
- Afgebakende labo-bench zone voor RNA werk
- Oppervlakten, pipetten, …: RNAse schoonmaakproduct, bv. RNAseZAP
- RNAse vrije filter-pipettips en plastics
- Nuclease-vrije oplossingen/water:
- Gefilterd water (Milli Q), RT-PCR grade water (getest op RNAsen)
- Behandeling met RNAse inhibitoren
- DEPC: reageert met amines in AZ in de katalytische site van RNAsen
en inhibeert die
- Nieuwere RNAse inhibitoren (minder carcinogeen)
Bewaring:
- RNAse-vrij water (of TE-buffer 10/1, maar EDTA inhibeert RNAse niet, itt. DNAsen)
- Bewaring tot 1 jaar op -80°C (minder lang dan DNA)
- Langere bewaring eventueel als alcoholprecipitaat
- Beter: meerdere aliquots staal in RNA bewaarmiddel voor latere RNA extractie
bewaren
DNA contaminatie:
- Niet altijd probleem, bv. niet wanneer toepassing onderscheid maakt tussen
DNA/RNA
- Detecteren: RT min controle, elektroforese
- Verwijderen: DNAse behandeling
- Toevoegen tijdens RNA extractie of behandeling van al geëxtraheerd RNA
- DNAsel (knipt dsDNA en ssDNA) of dsDNA-specifieke DNAsen
- Inactivatie (hitte) of verwijdering DNAse na behandeling
- Nadeel: verlies of degradatie van RNA mogelijk
2. RNA extraheren
Methode:
- Afhankelijk van startmateriaal (weefsel, bloed, bacteriecultuur, virussen)
- Afhankelijk van doel (hoeveelheid, kwaliteit)
Stappen:
- Lyseren: weefsel/cellen afbreken zodat RNA vrijkomt, lysaat = vloeistof met inhoud
van gelyseerde cellen, goede homogenisatie belangrijk
- Isoleren: RNA uit lysaat halen of opzuiveren (zonder eiwitten, eventueel zonder DNA)
- Oplossen: RNA in gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen, daarbij
concentreren
2
,Afbraak, lysis en homogenisatie van weefsels/cellen:
- Stap in extractie van DNA, RNA en eiwitten er bestaan verschillende methoden
- Vaak toevoeging van remmers van niet-gewenste moleculen, bv. DNAsen, RNAsen,
proteasen
- Detergenten, bv. SDS, Trizol, guanidium chloride (meest gebruikt)
- Vriezen en ontdooien (lyseert, cryopreservatie om cellen intact te houden)
- Mechanische homogenisatie: pletten in vloeibare stikstof tot poeder in mortier met
pestel, bead-gebaseerde homogenisator + schudden
aan hoge snelheid
- Vloeibare homogenisatie: dounce homogenisator of Douncer (oplossing tussen
glazen pestels) voordeel: mild, laat celfracties
(organellen) intact
- Sonicatie (geluidsgolven): gebruikt voor gewenste DNA fragmentatie, nadeel is dat
het ook DNA/RNA kan fragmenteren
2.1. RNA extractie met organische solventen (Trizol)
Trizol: acid (pH = 4,5) guanidium thiocyanaat – fenol – chloroform
Guanidium thiocyanaar: cellysis + RNAse inhibitor
Toevoegen, goed mengen, RNA (in waterlaag) nu gescheiden van DNA en eiwitten (in
organische laag + interfase = tussen 2 lagen)
Voordeel: eenvoudig, goedkoop, zeer goede opbrengst en zuiverheid
Waterlaag (met RNA) overbrengen naar nieuwe tube
Gevolgd door alcoholprecipitatie van RNA uit waterlaag of kolomchromatografie
Vergelijk met DNA extractie:
- Phenol – chloroform pH 7 voor DNA extractie en Trizol pH 4,5 voor RNA extractie
- Verschil in pH en lading DNA/RNA zorgt voor scheiding RNA in waterlaag en DNA in
waterlaag of organische laag/interfase
- Combinatie-methode: verder werken met beide lagen (voor DNA en RNA extractie)
2.2. Alcoholprecipitatie
Alcoholprecipitatie uit supernatans idem zoals voor DNA alcoholprecipitatie
Principe: DNA + RNA precipiteert in aanwezigheid van zout (bv. Na) + alcohol, DNA en RNA
lost terug op in water/buffer
Zouten: Natriumacetaat (andere voor specifieke toepassingen)
Alcoholen: ethanol of isopropanol
3
, 2.3. Kolomchromatografie
Principe:
- Silica kolom idem als bij DNA extractie
- Bepaalde condities van zout + pH: selectieve binding van RNA (DNA meestal niet
100% verwijderd)
- Andere condities zetten RNA terug vrij (elutie)
Vloeistof gaat door kolom op basis van: centrifugeren, zwaartekracht of vacuüm
Verschillende types kolom commercieel beschikbaar, bv. Qiagen:
- Voordeel: eenvoudig, zeer goede zuiverheid
- Nadeel: duurder, opbrengst beperkt door capaciteit van de kolommetjes
Automatisering: magnetische beads met silica toevoegen, met magneet beads uit oplossing
halen
Silica kolom:
- Buffer met chaotrope zouten (bv. guanidium chloride) lysis, nuclease inhibitie,
chaotroop zout zorgt voor selectieve binding van RNA aan silica kolom
- Spin kolom: vloeistof door kolom sturen door centrifugeren
- Elutie (losmaken): water/buffer zet RNA terug vrij
- Automatisering: magnetische beads met silica toevoegen, met magneet uit oplossing
halen bedoeling: grote schaal, high-throughput, automatisering
met robots Bv. Covid-19 diagnostische testen
3. RNA kwantificeren
Waarom:
- Inschatting opbrengst (extractie goed gelukt?), welke hoeveelheid is beschikbaar
voor experimenten
- Verschillende toepassingen vragen bepaalde concentratie/hoeveelheid RNA als input
- Afwijkende concentraties/hoeveelheden kunnen hinderen te laag: onvoldoende
input voor experiment, vooral voor weinig abundantie targets te hoog: mogelijk
inhibitie of saturatie (bv. ddPCR), meer is niet altijd beter
- Kwantificatiemethoden vergelijkbaar met DNA, maar met een aantal verschillen
Spectrofotometrie (UV/zichtbaar licht):
- Principe: absorptie van licht door RNA in oplossing
- Voordeel: snel, eenvoudig, concentratie + zuiverheid (eiwit, organische solventen)
- Nadeel: aspecifiek (absorptie door alle aanwezige moleculen), overschat
concentratie, geen onderscheid DNA-RNA (DNA contaminatie van RNA)
- Toepassing: ng/µl range
4
