CHEMISCHE EN BIOMEDISCHE ANALYSE
Inhoud
1. Inleiding ........................................................................................................................................... 6
1.1 Instrumentele analytische chemie .......................................................................................... 6
1.2 De analytische benadering ............................................................................................................ 7
2. Algemene principes van de spectroscopie ........................................................................................ 10
2.1 Interactie tussen elektromagnetische straling en materie .......................................................... 10
2.2 Atoom- en molecuulspectroscopie.............................................................................................. 12
2.3 Absorptiewetten .......................................................................................................................... 12
2.4 Monochromators of golflengteselectie ....................................................................................... 13
3. Nucleair magnetische resonantie ...................................................................................................... 15
3.1 Inleiding ....................................................................................................................................... 15
3.2 Opname van het NMR-spectrum................................................................................................. 16
3.3 Relaxatieprocessen ...................................................................................................................... 17
3.4 Instrumentatie ............................................................................................................................. 17
3.5 Chemische shift ........................................................................................................................... 18
3.6 Hyperfijnstructuur: spin-spin koppeling ...................................................................................... 19
3.7 Toepassing van NMR.................................................................................................................... 20
4. Infraroodspectroscopie ..................................................................................................................... 21
4.1 Absorptie van IR-straling door moleculen ................................................................................... 21
4.2 Instrumentatie ............................................................................................................................. 23
4.3 onderdelen van de IR spectrometer ...................................................................................... 24
4.4 monsteranalysetechnieken.......................................................................................................... 25
4.5 toepassingen ............................................................................................................................... 26
5. UV/Vis absorptiespectroscopie ......................................................................................................... 27
5.1 Principe ........................................................................................................................................ 27
5.2 Elektronenspectra van moleculen ............................................................................................... 27
5.3 Lichtabsorptie door moleculen.................................................................................................... 27
5.4 Absorptiecurven .......................................................................................................................... 28
5.5 Instrumentatie ............................................................................................................................. 28
5.6 Toepassingen van UV/VIS spectrofotometrie .............................................................................. 31
5.7 Visuele colorimetrie .................................................................................................................... 32
5.8 Kwantitatieve bepaling in het UV/VIS .......................................................................................... 32
5.9 Multicomponent analyse (MCA) ................................................................................................. 32
6. Fluorimetrie ....................................................................................................................................... 33
1
, 6.1 Principe ........................................................................................................................................ 33
6.2 Verband tussen fluorescentie en concentratie............................................................................ 33
6.3 Instrumentatie ............................................................................................................................. 34
6.4 Toepassingen ............................................................................................................................... 35
6.5 Chemiluminiscentie = CL ............................................................................................................. 35
6.6 Lichtverstrooiing: turbidimetrie en nefelometrie ........................................................................ 36
7. Atomaire absorptiespectroscopie ..................................................................................................... 37
7.1 Absorptie van straling door atomen ............................................................................................ 37
7.2 Instrumentatie ............................................................................................................................. 37
7.3 Niet-specifieke absorptie ............................................................................................................. 39
7.4 Interferenties ......................................................................................................................... 40
7.5 Concentratiebepaling ............................................................................................................ 40
7.6 Toepassingen ......................................................................................................................... 41
8. Atomaire emissiespectroscopie......................................................................................................... 42
8.1 Atomaire emissiespectra ............................................................................................................. 42
8.2 Vlamfotometrie ........................................................................................................................... 42
8.3 Inductief gekoppeld plasma = ICP ............................................................................................... 43
8.4 Gehyfeneerde technieken ........................................................................................................... 44
8.5 Toepassingen ............................................................................................................................... 44
9. X-straalspectroscopie......................................................................................................................... 45
9.1 X-straalspectra ............................................................................................................................. 45
9.2 X-straalmethoden .................................................................................................................. 46
Absorptie van X-stralen ..................................................................................................................... 46
X-straalfluorescentie .......................................................................................................................... 46
Diffractie van X-stralen ...................................................................................................................... 47
9.3 X-straal generators....................................................................................................................... 47
9.3 X-straal fluorescentiespectrometers...................................................................................... 48
9.5 Kwalitatieve en kwantitatieve analyse met XRF .......................................................................... 51
9.6 X-straalkristallografie ................................................................................................................... 53
10. Massaspectroscopie ........................................................................................................................ 55
10.1 Principe ...................................................................................................................................... 55
10.2 Bepaling van de massa/lading verhouding: principe van brainridge MS .................................. 55
10.3 Het massaspectrum ................................................................................................................... 56
10.4 Monsterintroductietechnieken.................................................................................................. 56
10.5 Instrumentatie: ionisatie ........................................................................................................... 57
10.6 Instrumentatie: massa-analysator ............................................................................................. 59
2
, 10.7 Performantie van massaspectrometers..................................................................................... 61
10.8 Instrumentatie: iondetectoren .................................................................................................. 61
10.9 Toepassingen ............................................................................................................................. 62
11. Elektrochemische methoden........................................................................................................... 63
12. Conductometrie............................................................................................................................... 63
12.1 Elektrische geleidbaarheid ........................................................................................................ 64
12.2 Bepaling van de conductiviteit .................................................................................................. 65
12.3 Moleculaire conductiviteit......................................................................................................... 65
12.4 Toepassingen ............................................................................................................................. 66
13. Potentiometrie ................................................................................................................................ 67
13.1 Algemene principes ................................................................................................................... 67
13.2 De pH-elektrode ........................................................................................................................ 68
13.3 Ionselectieve elektroden ........................................................................................................... 68
13.4 Potentiometrische methoden ................................................................................................... 69
14. Voltametrie-Polarografie ................................................................................................................ 71
14.1 Algemene principes micro-elektrolyse ...................................................................................... 71
14.2 Werkelektroden ..................................................................................................................... 72
14.3 De diffusiestroom .................................................................................................................. 73
14.4 Gelijkstroommethoden ......................................................................................................... 73
14.5 Pulspolarografie......................................................................................................................... 75
14.5 Stripping voltametrie ............................................................................................................. 75
14.6 Voltametrie als detectiemethode .......................................................................................... 76
15. Coulometrie ..................................................................................................................................... 77
15.1 Principe ...................................................................................................................................... 77
15.2 Karl Fischer methode voor de bepaling van water .................................................................... 78
16. Algemene principes van de chromatografie .................................................................................... 79
16.1 Inleiding ..................................................................................................................................... 79
16.2 Indeling van de chromatografische technieken......................................................................... 79
16.3 Het chromatogram ................................................................................................................ 81
16.4 Het theoretische plaatmodel................................................................................................. 82
16.5 Retentieparameters ................................................................................................................... 83
16.6 Scheidingsfactor tussen 2 componenten .................................................................................. 84
16.7 Piekresolutie .............................................................................................................................. 84
16.8 Kolomvariantie........................................................................................................................... 84
16.9 Extra kolomvariantie .............................................................................................................. 86
16.10 Optimalisatie van de chromatografische analyse .................................................................... 86
3
, 16.11 Ontwikkelen van een chromatogram ...................................................................................... 87
16.12 Kwalitatieve en kwantitatieve chromatografische analyse ..................................................... 87
17. Gaschromatografie .......................................................................................................................... 88
17.1 De gaschromatograaf ............................................................................................................ 88
17.2 Draaggas en debietregeling ................................................................................................... 88
17.3 Injectiesystemen .................................................................................................................... 88
17.4 Kolomtyypes .............................................................................................................................. 90
17.5 Vloeibare stationaire fasen (GLC) .......................................................................................... 90
17.6 Vaste stationaire fasen (GSC) ................................................................................................. 91
17.7 Detectiesystemen ...................................................................................................................... 91
17.8 Derivisatie van verbindingen ..................................................................................................... 94
17.9 Kovats retentie index ................................................................................................................. 94
18. Hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC) ..................................................................................... 95
18.1 Pompen en gradiëntelutie ......................................................................................................... 95
18.2 Injectors ..................................................................................................................................... 96
18.3 Kolommen ................................................................................................................................. 96
18.4 Stationaire fasen ........................................................................................................................ 96
18.5 Detectoren ................................................................................................................................. 97
19. Ionchromatografie (IC) .................................................................................................................. 101
19.1 Mobiele fasen .......................................................................................................................... 101
19.2 Stationaire fasen .................................................................................................................. 101
19.3 Het scheidingsprincipe ............................................................................................................ 102
19.4 Detectoren ............................................................................................................................... 102
20. Exclusie chromatografie ................................................................................................................ 103
20.1 Principe .................................................................................................................................... 103
20.2 Stationaire fasen ...................................................................................................................... 103
20.3 Instrumentatie ......................................................................................................................... 104
20.4 Toepassingen ........................................................................................................................... 104
21. Elektroforetische technieken ......................................................................................................... 105
21.1 Principe van de elektroforese .................................................................................................. 105
21.2 Elektroforetische en elektro-osmotische mobiliteit ................................................................ 105
21.3 Zone-elektroforese .................................................................................................................. 106
21.4 Capillaire vrije-zone elektroforese (CZE) ................................................................................. 107
21.5 Micellaire elektrokinetische capillaire chromatografie (MEKC) .............................................. 107
21.6 Capillaire gelelektroforese (CGE) ............................................................................................. 108
21.7 Capillaire iso-elektrische focusering (CIEF).............................................................................. 108
4
,21.8 Injectiemethoden .................................................................................................................... 108
21.9 Detectiemethoden .................................................................................................................. 109
21.10 Capillaire elektroforese versus HPLC ............................................................................... 109
5
,1. Inleiding
− Chemische analyse
• Informatie verschaffen over …
o Natuur van de materie
o Samenstelling van de materie
o Structuur van een bestanddeel (geheel of gedeeltelijk) in monsters van
uiteenlopende complexiteit
• Gebaseerd op fysicochemische metingen met uitgebreid instrumentenpark
! analytische apparatuur van groot belang voor onderzoek in de …
o Proteïnechemie
o Moleculaire biologie
o Medische wetenschappen
o Voedingsindustrie: zware metalen, PCB’s, hormonen, …
o Milieuwetenschappen
o Materiaalwetenschappen
➔ inzicht en kennis van apparatuur is essentieel
− Taak van de biomedicus
• Doordachte keuze van meest geschikte meetmethode maken
• Keuze in praktijk toepassen
• Onderkennen van mogelijke beperkingen en/of moeilijkheden
• Problemen oplossen
1.1 Instrumentele analytische chemie
− kwalitatieve en kwantitatieve karakterisering van de materie
• Kwalitatieve analyse
= identificatie van één of meer chemische bestanddelen
• Kwantitatieve analyse
= bepaling van de hoeveelheid van species in een monster
! a.d.h.v. meting van fysicochemische parameters
o Molariteit = # mol bestanddeel per liter monster = M = mol/l
o Gewichtspercentage = # gram bestanddeel per gram monster = % = %w/w
o Parts per million = # microgram bestanddeel per gram monster = ppm = μg/g
• Chemisch bestanddeel = species = element, ion of (an)organische verbinding
• Materie
o Ganse monster = bulk analyse
o Oppervlak van het monster = oppervlakteanalyse
− Nat chemische methoden instrumentele methoden
• Nat-chemische methode: gebaseerd op chemische reactie om componenten in een
monster te identificeren en te bepalen
! hoge mate van ervaring + tijdrovend + inherent destructief
• Niet-destructieve instrumentele methode
o Uitgevoerd door specifiek ontworpen elektronische instrumenten
gecontroleerd en gestuurd met computers
o Werking:
- Interactie van materie met elektromagnetische straling
- Specifieke eigenschap van de materie
6
,1.2 De analytische benadering
Probleemstelling
= definiëren van probleem
− Vraagstelling: welke informatie wenst men te bekomen over monster/materiaal/proces
• Samenstelling van het monster
o Analyt = het te bepalen bestanddeel
o Matrix = begeleidende bestanddelen
! nagaan of deze interfereren met metingen
Interfererende bestanddelen
Kwalitatieve analyse
− Elementanalyse: elementen in monster identificeren
• Niet-destructief
Bv. XRF (= X-straal fluorescentiespectroscopie)
• Destructief
Bv. ICP-OES of ICP-AES (plasma atoom emissiespectrometrie): identificatie van alle
elementen van PSE uit oplossing
− Moleculaire analyse: moleculen in een materiaal identificeren
• Niet-destructief
Bv. NMR (=nucleaire magnetische resonantiespectroscopie): protonen, koolstof,
andere atomen in chemische verbindingen en hoe atomen verbonden zijn
Bv. IR (infrarood spectroscopie): organische functionele groepen
• Destructief
Kwantitatieve analyse
− Elementanalyse
• Niet-destructief
Bv. XRF, elektrochemische methoden
• Destructief
Bv. AAS (=atoom absorptiespectrometrie), AES (=atoom emissiespectrometrie)
− Moleculaire analyse
• Niet-destructief
Bv. CE (= capillaire elektroforese): bepaling specifieke bestanddelen,
GC (=gaschromatografie) en IR: meet hoeveelheid vrijgesteld gas
• Destructief
Bv. GC, CE, GC-MS (=gehypeneerde techniek)
Keuze van de analytische methode en meettechniek
− Gevoeligheid van concentratiegebied
− Blanco: vergewissen van interferenties bij analyse
• Zuiver oplosmiddel (gebruikt voor bereiding van monsters): instellen basislijn
• Reagens blanco = alle reagentia om monster voor te bereiden op analyse: instellen
basislijn
• Matrix blanco = chemische identiek aan monster (zonder bestanddeel): corrigeren
van spectraallijnen afkomstig van matrix
7
, − Kalibratiestandaard = laboratoriumstandaard
• Bevat gekende concentratie van het te bepalen bestanddeel
• Legt verband tussen
o Analytisch signaal gemeten door instrument
o Concentratie van het te bepalen bestanddeel
− Referentiestandaard
• Bevat gekende samenstelling + concentratie van het te bepalen bestanddeel
• Controle van analytische procedure
• Bepaalt nauwkeurigheid en precisie van de methode
Monstername, monstervoorbereiding en bewaring
− Monstername
• Representatief voor het materiaal
! Niet gecontamineerd
− Monstervoorbereiding
• Verwijderen van gead(ab)sorbeerde onzuiverheden
• Omzetten in een meetbare vorm
o Scheiding of verwijderen van interfererende bestanddelen
Bv. verkleinen, oplossen, extractie, precipitatie, vervluchtigen, …
− Bewaring
• Samenstelling mag niet veranderen door
o Reactie met lucht of licht
- Bewaren onder inert gas of donker
- Invriezen van het materiaal
- Hoge temperaturen of vochtigheid vermijden
- Bewaringsmiddel toevoegen
o Interactie met recipiënt: contaminatie of adsorptie
Uitvoering van de bepaling
− Gemeten fysische parameters
Bv. geabsorbeerd licht, geëmitteerd licht, potentiaalverschil, elektrische stroom
➔ hoeveelheid te bepalen bestanddeel aanwezig in oorspronkelijke monster
• Waarneming van signaal
o Detector: meet fysische, chemische of elektrische signalen
OF Transducer: zet niet-elektrische signalen om in elektrische signalen
- Basislijn + analytisch signaal
! ruis op basislijn = achtergrondschommelingen
- Signaal-tot-ruis verhouding = S/N
▪ Betrouwbare meting: grote S/N
• Kalibratie: verband tussen meetsignaal en concentratie van het te
bepalen bestanddeel
o Kalibratielijn: grootte van meetsignaal i.f.v. concentratie
= S = a + b*C ➔ C = (S-a)/b
- S = gemeten signaal
- C = concentratie
- b = richtingscoëfficient
- a = intercept
8
, o Grafische bepaling
Mathematische bepaling
Bv. Excel, calculator of instrumentele software
▪ Standaardfout
▪ Niet-lineaire kalibaratie
Evaluatie van de meetresultaten
− Specificiteit: mogelijkheid om enkel en alleen een specifiek bestanddeel te bepalen in
aanwezigheid van interferenties
+ selectiviteit
− Sensitiviteit of gevoeligheid
= richtingscoëfficiënt van kalibratielijn
− Lineair werkingsgebied
= interval tussen laagste en hoogste concentratie van bestanddeel
! met gestelde nauwkeurigheid, precisie en lineariteit
Juistheid en precisie
− Accuratesse of juistheid
= aangeven van verschil tussen gemeten concentratie en werkelijke waarde: bias
− Precisie of herhaal-/reproduceerbaarheid
= aangeven van hoeverre herhaalde metingen van concentratie overeenkomen
Detectielimiet – aantoonbaarheidsgrens
= detectiegrens (LOD)
= laagste concentratie van een bestanddeel die men in een monster kan detecteren
! detecteren ≠ kwantificeren
• Concentratie waarvoor S/N = 2 (95% betrouwbaarheidsgrens)
• Concentratie waarvoor S/N = 3 (99% betrouwbaarheidsgrens)
Bepalingslimiet
= bepalingsgrens (LOQ)
= laagste concentratie van bestanddeel die met bepaalde nauwkeurigheid en precisie kwantitatief kan
bepaald worden
• Concentratie waarvoor S/N = 10
• Concentratie waarvoor c = 10 * Sblanco (=standaardafwijking van blanco)
9
, 2. Algemene principes van de spectroscopie
2.1 Interactie tussen elektromagnetische straling en materie
Bv. wit licht na doorgang doorheen kaliumpermangaat kleurt purper
Elektromagnetische straling
− Interactie van stralingsenergie met materie
Absorptie of emissie van elektromagnetische straling
• Kwalitatief criterium
= golflengte/energie van de geabsorbeerde of geëmitteerde straling
• Kwantitatief criterium
= intensiteit
− Straling: dualistisch of tweeslachtig karakter
• Stroom energiedeeltjes (=fotonen)
o Quantumenergie = hoeveelheid energie per foton
-
▪ eV = elektronenvolt = 1.602 * 10-19 C*V
= 8065 cm-1
-
▪ h = constante van Planck = 6.626 * 10-34 Js
▪ Na = 6.0221 * 1023 mol
▪ = golfgetal: aantal golven in cm-1
! korte golflengte = hoge frequentie = hoge energie
• Golfverschijnsel
o Vormt basis voor optische eigenschappen
Bv. reflectie, dispersie, breking en lenswerking
o Voorplanting: transversale golfbeweging
⊥ elektrisch veld = Eyz: verandert sinusoïdaal van grootte en teken
⊥ magnetisch veld = Bxy: verandert sinusoïdaal
o Golfkarakter
- v = frequentie = aantal golven per seconde in Hz
- λ = golflengte
- u = voortplantingssnelheid
▪ In vacuüm: u van EM overal gelijk
▪ In materie: u vertraagt door breking
! n: afhankelijk van golflengte
Spectroscopie
− Studie van interactie tussen stralingsenergie en materie
• Interactie met atomen = atoomspectroscopie
• Interactie met moleculen = molecuulspectroscopie
− Golflengte van de betrokken straling
10
Inhoud
1. Inleiding ........................................................................................................................................... 6
1.1 Instrumentele analytische chemie .......................................................................................... 6
1.2 De analytische benadering ............................................................................................................ 7
2. Algemene principes van de spectroscopie ........................................................................................ 10
2.1 Interactie tussen elektromagnetische straling en materie .......................................................... 10
2.2 Atoom- en molecuulspectroscopie.............................................................................................. 12
2.3 Absorptiewetten .......................................................................................................................... 12
2.4 Monochromators of golflengteselectie ....................................................................................... 13
3. Nucleair magnetische resonantie ...................................................................................................... 15
3.1 Inleiding ....................................................................................................................................... 15
3.2 Opname van het NMR-spectrum................................................................................................. 16
3.3 Relaxatieprocessen ...................................................................................................................... 17
3.4 Instrumentatie ............................................................................................................................. 17
3.5 Chemische shift ........................................................................................................................... 18
3.6 Hyperfijnstructuur: spin-spin koppeling ...................................................................................... 19
3.7 Toepassing van NMR.................................................................................................................... 20
4. Infraroodspectroscopie ..................................................................................................................... 21
4.1 Absorptie van IR-straling door moleculen ................................................................................... 21
4.2 Instrumentatie ............................................................................................................................. 23
4.3 onderdelen van de IR spectrometer ...................................................................................... 24
4.4 monsteranalysetechnieken.......................................................................................................... 25
4.5 toepassingen ............................................................................................................................... 26
5. UV/Vis absorptiespectroscopie ......................................................................................................... 27
5.1 Principe ........................................................................................................................................ 27
5.2 Elektronenspectra van moleculen ............................................................................................... 27
5.3 Lichtabsorptie door moleculen.................................................................................................... 27
5.4 Absorptiecurven .......................................................................................................................... 28
5.5 Instrumentatie ............................................................................................................................. 28
5.6 Toepassingen van UV/VIS spectrofotometrie .............................................................................. 31
5.7 Visuele colorimetrie .................................................................................................................... 32
5.8 Kwantitatieve bepaling in het UV/VIS .......................................................................................... 32
5.9 Multicomponent analyse (MCA) ................................................................................................. 32
6. Fluorimetrie ....................................................................................................................................... 33
1
, 6.1 Principe ........................................................................................................................................ 33
6.2 Verband tussen fluorescentie en concentratie............................................................................ 33
6.3 Instrumentatie ............................................................................................................................. 34
6.4 Toepassingen ............................................................................................................................... 35
6.5 Chemiluminiscentie = CL ............................................................................................................. 35
6.6 Lichtverstrooiing: turbidimetrie en nefelometrie ........................................................................ 36
7. Atomaire absorptiespectroscopie ..................................................................................................... 37
7.1 Absorptie van straling door atomen ............................................................................................ 37
7.2 Instrumentatie ............................................................................................................................. 37
7.3 Niet-specifieke absorptie ............................................................................................................. 39
7.4 Interferenties ......................................................................................................................... 40
7.5 Concentratiebepaling ............................................................................................................ 40
7.6 Toepassingen ......................................................................................................................... 41
8. Atomaire emissiespectroscopie......................................................................................................... 42
8.1 Atomaire emissiespectra ............................................................................................................. 42
8.2 Vlamfotometrie ........................................................................................................................... 42
8.3 Inductief gekoppeld plasma = ICP ............................................................................................... 43
8.4 Gehyfeneerde technieken ........................................................................................................... 44
8.5 Toepassingen ............................................................................................................................... 44
9. X-straalspectroscopie......................................................................................................................... 45
9.1 X-straalspectra ............................................................................................................................. 45
9.2 X-straalmethoden .................................................................................................................. 46
Absorptie van X-stralen ..................................................................................................................... 46
X-straalfluorescentie .......................................................................................................................... 46
Diffractie van X-stralen ...................................................................................................................... 47
9.3 X-straal generators....................................................................................................................... 47
9.3 X-straal fluorescentiespectrometers...................................................................................... 48
9.5 Kwalitatieve en kwantitatieve analyse met XRF .......................................................................... 51
9.6 X-straalkristallografie ................................................................................................................... 53
10. Massaspectroscopie ........................................................................................................................ 55
10.1 Principe ...................................................................................................................................... 55
10.2 Bepaling van de massa/lading verhouding: principe van brainridge MS .................................. 55
10.3 Het massaspectrum ................................................................................................................... 56
10.4 Monsterintroductietechnieken.................................................................................................. 56
10.5 Instrumentatie: ionisatie ........................................................................................................... 57
10.6 Instrumentatie: massa-analysator ............................................................................................. 59
2
, 10.7 Performantie van massaspectrometers..................................................................................... 61
10.8 Instrumentatie: iondetectoren .................................................................................................. 61
10.9 Toepassingen ............................................................................................................................. 62
11. Elektrochemische methoden........................................................................................................... 63
12. Conductometrie............................................................................................................................... 63
12.1 Elektrische geleidbaarheid ........................................................................................................ 64
12.2 Bepaling van de conductiviteit .................................................................................................. 65
12.3 Moleculaire conductiviteit......................................................................................................... 65
12.4 Toepassingen ............................................................................................................................. 66
13. Potentiometrie ................................................................................................................................ 67
13.1 Algemene principes ................................................................................................................... 67
13.2 De pH-elektrode ........................................................................................................................ 68
13.3 Ionselectieve elektroden ........................................................................................................... 68
13.4 Potentiometrische methoden ................................................................................................... 69
14. Voltametrie-Polarografie ................................................................................................................ 71
14.1 Algemene principes micro-elektrolyse ...................................................................................... 71
14.2 Werkelektroden ..................................................................................................................... 72
14.3 De diffusiestroom .................................................................................................................. 73
14.4 Gelijkstroommethoden ......................................................................................................... 73
14.5 Pulspolarografie......................................................................................................................... 75
14.5 Stripping voltametrie ............................................................................................................. 75
14.6 Voltametrie als detectiemethode .......................................................................................... 76
15. Coulometrie ..................................................................................................................................... 77
15.1 Principe ...................................................................................................................................... 77
15.2 Karl Fischer methode voor de bepaling van water .................................................................... 78
16. Algemene principes van de chromatografie .................................................................................... 79
16.1 Inleiding ..................................................................................................................................... 79
16.2 Indeling van de chromatografische technieken......................................................................... 79
16.3 Het chromatogram ................................................................................................................ 81
16.4 Het theoretische plaatmodel................................................................................................. 82
16.5 Retentieparameters ................................................................................................................... 83
16.6 Scheidingsfactor tussen 2 componenten .................................................................................. 84
16.7 Piekresolutie .............................................................................................................................. 84
16.8 Kolomvariantie........................................................................................................................... 84
16.9 Extra kolomvariantie .............................................................................................................. 86
16.10 Optimalisatie van de chromatografische analyse .................................................................... 86
3
, 16.11 Ontwikkelen van een chromatogram ...................................................................................... 87
16.12 Kwalitatieve en kwantitatieve chromatografische analyse ..................................................... 87
17. Gaschromatografie .......................................................................................................................... 88
17.1 De gaschromatograaf ............................................................................................................ 88
17.2 Draaggas en debietregeling ................................................................................................... 88
17.3 Injectiesystemen .................................................................................................................... 88
17.4 Kolomtyypes .............................................................................................................................. 90
17.5 Vloeibare stationaire fasen (GLC) .......................................................................................... 90
17.6 Vaste stationaire fasen (GSC) ................................................................................................. 91
17.7 Detectiesystemen ...................................................................................................................... 91
17.8 Derivisatie van verbindingen ..................................................................................................... 94
17.9 Kovats retentie index ................................................................................................................. 94
18. Hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC) ..................................................................................... 95
18.1 Pompen en gradiëntelutie ......................................................................................................... 95
18.2 Injectors ..................................................................................................................................... 96
18.3 Kolommen ................................................................................................................................. 96
18.4 Stationaire fasen ........................................................................................................................ 96
18.5 Detectoren ................................................................................................................................. 97
19. Ionchromatografie (IC) .................................................................................................................. 101
19.1 Mobiele fasen .......................................................................................................................... 101
19.2 Stationaire fasen .................................................................................................................. 101
19.3 Het scheidingsprincipe ............................................................................................................ 102
19.4 Detectoren ............................................................................................................................... 102
20. Exclusie chromatografie ................................................................................................................ 103
20.1 Principe .................................................................................................................................... 103
20.2 Stationaire fasen ...................................................................................................................... 103
20.3 Instrumentatie ......................................................................................................................... 104
20.4 Toepassingen ........................................................................................................................... 104
21. Elektroforetische technieken ......................................................................................................... 105
21.1 Principe van de elektroforese .................................................................................................. 105
21.2 Elektroforetische en elektro-osmotische mobiliteit ................................................................ 105
21.3 Zone-elektroforese .................................................................................................................. 106
21.4 Capillaire vrije-zone elektroforese (CZE) ................................................................................. 107
21.5 Micellaire elektrokinetische capillaire chromatografie (MEKC) .............................................. 107
21.6 Capillaire gelelektroforese (CGE) ............................................................................................. 108
21.7 Capillaire iso-elektrische focusering (CIEF).............................................................................. 108
4
,21.8 Injectiemethoden .................................................................................................................... 108
21.9 Detectiemethoden .................................................................................................................. 109
21.10 Capillaire elektroforese versus HPLC ............................................................................... 109
5
,1. Inleiding
− Chemische analyse
• Informatie verschaffen over …
o Natuur van de materie
o Samenstelling van de materie
o Structuur van een bestanddeel (geheel of gedeeltelijk) in monsters van
uiteenlopende complexiteit
• Gebaseerd op fysicochemische metingen met uitgebreid instrumentenpark
! analytische apparatuur van groot belang voor onderzoek in de …
o Proteïnechemie
o Moleculaire biologie
o Medische wetenschappen
o Voedingsindustrie: zware metalen, PCB’s, hormonen, …
o Milieuwetenschappen
o Materiaalwetenschappen
➔ inzicht en kennis van apparatuur is essentieel
− Taak van de biomedicus
• Doordachte keuze van meest geschikte meetmethode maken
• Keuze in praktijk toepassen
• Onderkennen van mogelijke beperkingen en/of moeilijkheden
• Problemen oplossen
1.1 Instrumentele analytische chemie
− kwalitatieve en kwantitatieve karakterisering van de materie
• Kwalitatieve analyse
= identificatie van één of meer chemische bestanddelen
• Kwantitatieve analyse
= bepaling van de hoeveelheid van species in een monster
! a.d.h.v. meting van fysicochemische parameters
o Molariteit = # mol bestanddeel per liter monster = M = mol/l
o Gewichtspercentage = # gram bestanddeel per gram monster = % = %w/w
o Parts per million = # microgram bestanddeel per gram monster = ppm = μg/g
• Chemisch bestanddeel = species = element, ion of (an)organische verbinding
• Materie
o Ganse monster = bulk analyse
o Oppervlak van het monster = oppervlakteanalyse
− Nat chemische methoden instrumentele methoden
• Nat-chemische methode: gebaseerd op chemische reactie om componenten in een
monster te identificeren en te bepalen
! hoge mate van ervaring + tijdrovend + inherent destructief
• Niet-destructieve instrumentele methode
o Uitgevoerd door specifiek ontworpen elektronische instrumenten
gecontroleerd en gestuurd met computers
o Werking:
- Interactie van materie met elektromagnetische straling
- Specifieke eigenschap van de materie
6
,1.2 De analytische benadering
Probleemstelling
= definiëren van probleem
− Vraagstelling: welke informatie wenst men te bekomen over monster/materiaal/proces
• Samenstelling van het monster
o Analyt = het te bepalen bestanddeel
o Matrix = begeleidende bestanddelen
! nagaan of deze interfereren met metingen
Interfererende bestanddelen
Kwalitatieve analyse
− Elementanalyse: elementen in monster identificeren
• Niet-destructief
Bv. XRF (= X-straal fluorescentiespectroscopie)
• Destructief
Bv. ICP-OES of ICP-AES (plasma atoom emissiespectrometrie): identificatie van alle
elementen van PSE uit oplossing
− Moleculaire analyse: moleculen in een materiaal identificeren
• Niet-destructief
Bv. NMR (=nucleaire magnetische resonantiespectroscopie): protonen, koolstof,
andere atomen in chemische verbindingen en hoe atomen verbonden zijn
Bv. IR (infrarood spectroscopie): organische functionele groepen
• Destructief
Kwantitatieve analyse
− Elementanalyse
• Niet-destructief
Bv. XRF, elektrochemische methoden
• Destructief
Bv. AAS (=atoom absorptiespectrometrie), AES (=atoom emissiespectrometrie)
− Moleculaire analyse
• Niet-destructief
Bv. CE (= capillaire elektroforese): bepaling specifieke bestanddelen,
GC (=gaschromatografie) en IR: meet hoeveelheid vrijgesteld gas
• Destructief
Bv. GC, CE, GC-MS (=gehypeneerde techniek)
Keuze van de analytische methode en meettechniek
− Gevoeligheid van concentratiegebied
− Blanco: vergewissen van interferenties bij analyse
• Zuiver oplosmiddel (gebruikt voor bereiding van monsters): instellen basislijn
• Reagens blanco = alle reagentia om monster voor te bereiden op analyse: instellen
basislijn
• Matrix blanco = chemische identiek aan monster (zonder bestanddeel): corrigeren
van spectraallijnen afkomstig van matrix
7
, − Kalibratiestandaard = laboratoriumstandaard
• Bevat gekende concentratie van het te bepalen bestanddeel
• Legt verband tussen
o Analytisch signaal gemeten door instrument
o Concentratie van het te bepalen bestanddeel
− Referentiestandaard
• Bevat gekende samenstelling + concentratie van het te bepalen bestanddeel
• Controle van analytische procedure
• Bepaalt nauwkeurigheid en precisie van de methode
Monstername, monstervoorbereiding en bewaring
− Monstername
• Representatief voor het materiaal
! Niet gecontamineerd
− Monstervoorbereiding
• Verwijderen van gead(ab)sorbeerde onzuiverheden
• Omzetten in een meetbare vorm
o Scheiding of verwijderen van interfererende bestanddelen
Bv. verkleinen, oplossen, extractie, precipitatie, vervluchtigen, …
− Bewaring
• Samenstelling mag niet veranderen door
o Reactie met lucht of licht
- Bewaren onder inert gas of donker
- Invriezen van het materiaal
- Hoge temperaturen of vochtigheid vermijden
- Bewaringsmiddel toevoegen
o Interactie met recipiënt: contaminatie of adsorptie
Uitvoering van de bepaling
− Gemeten fysische parameters
Bv. geabsorbeerd licht, geëmitteerd licht, potentiaalverschil, elektrische stroom
➔ hoeveelheid te bepalen bestanddeel aanwezig in oorspronkelijke monster
• Waarneming van signaal
o Detector: meet fysische, chemische of elektrische signalen
OF Transducer: zet niet-elektrische signalen om in elektrische signalen
- Basislijn + analytisch signaal
! ruis op basislijn = achtergrondschommelingen
- Signaal-tot-ruis verhouding = S/N
▪ Betrouwbare meting: grote S/N
• Kalibratie: verband tussen meetsignaal en concentratie van het te
bepalen bestanddeel
o Kalibratielijn: grootte van meetsignaal i.f.v. concentratie
= S = a + b*C ➔ C = (S-a)/b
- S = gemeten signaal
- C = concentratie
- b = richtingscoëfficient
- a = intercept
8
, o Grafische bepaling
Mathematische bepaling
Bv. Excel, calculator of instrumentele software
▪ Standaardfout
▪ Niet-lineaire kalibaratie
Evaluatie van de meetresultaten
− Specificiteit: mogelijkheid om enkel en alleen een specifiek bestanddeel te bepalen in
aanwezigheid van interferenties
+ selectiviteit
− Sensitiviteit of gevoeligheid
= richtingscoëfficiënt van kalibratielijn
− Lineair werkingsgebied
= interval tussen laagste en hoogste concentratie van bestanddeel
! met gestelde nauwkeurigheid, precisie en lineariteit
Juistheid en precisie
− Accuratesse of juistheid
= aangeven van verschil tussen gemeten concentratie en werkelijke waarde: bias
− Precisie of herhaal-/reproduceerbaarheid
= aangeven van hoeverre herhaalde metingen van concentratie overeenkomen
Detectielimiet – aantoonbaarheidsgrens
= detectiegrens (LOD)
= laagste concentratie van een bestanddeel die men in een monster kan detecteren
! detecteren ≠ kwantificeren
• Concentratie waarvoor S/N = 2 (95% betrouwbaarheidsgrens)
• Concentratie waarvoor S/N = 3 (99% betrouwbaarheidsgrens)
Bepalingslimiet
= bepalingsgrens (LOQ)
= laagste concentratie van bestanddeel die met bepaalde nauwkeurigheid en precisie kwantitatief kan
bepaald worden
• Concentratie waarvoor S/N = 10
• Concentratie waarvoor c = 10 * Sblanco (=standaardafwijking van blanco)
9
, 2. Algemene principes van de spectroscopie
2.1 Interactie tussen elektromagnetische straling en materie
Bv. wit licht na doorgang doorheen kaliumpermangaat kleurt purper
Elektromagnetische straling
− Interactie van stralingsenergie met materie
Absorptie of emissie van elektromagnetische straling
• Kwalitatief criterium
= golflengte/energie van de geabsorbeerde of geëmitteerde straling
• Kwantitatief criterium
= intensiteit
− Straling: dualistisch of tweeslachtig karakter
• Stroom energiedeeltjes (=fotonen)
o Quantumenergie = hoeveelheid energie per foton
-
▪ eV = elektronenvolt = 1.602 * 10-19 C*V
= 8065 cm-1
-
▪ h = constante van Planck = 6.626 * 10-34 Js
▪ Na = 6.0221 * 1023 mol
▪ = golfgetal: aantal golven in cm-1
! korte golflengte = hoge frequentie = hoge energie
• Golfverschijnsel
o Vormt basis voor optische eigenschappen
Bv. reflectie, dispersie, breking en lenswerking
o Voorplanting: transversale golfbeweging
⊥ elektrisch veld = Eyz: verandert sinusoïdaal van grootte en teken
⊥ magnetisch veld = Bxy: verandert sinusoïdaal
o Golfkarakter
- v = frequentie = aantal golven per seconde in Hz
- λ = golflengte
- u = voortplantingssnelheid
▪ In vacuüm: u van EM overal gelijk
▪ In materie: u vertraagt door breking
! n: afhankelijk van golflengte
Spectroscopie
− Studie van interactie tussen stralingsenergie en materie
• Interactie met atomen = atoomspectroscopie
• Interactie met moleculen = molecuulspectroscopie
− Golflengte van de betrokken straling
10
