Samenvatting toolbox PCR

1. PCR

1.1. Wat is PCR

 Polymerase Chain Reaction of
 polymerase ketting reactie
 Belangrijke biotechnologische tool om 1 stukje DNA (of RNA) in vitro miljoenen keer
te vermenigvuldigen in een korte tijd (een paar uur)
 PCR reactie lijkt erg op de replicatie van DNA zoals die in de natuur plaatsvindt
 DNA replicatie (zie knowledge 4.4): verdubbeling DNA bij celdeling
 PCR reactie = in vitro versie van DNA replicatie
 ! veel meer dan 2x
 Vermenigvuldiging stukje DNA tot miljarden kopijen
 kort tijdsbestek (2-3 uur)
 Diagnose ziekte, opsporen genen,…
 Identificatie bacteriën en virussen e.a. micro-organismen (bv. aantonen
ziekteverwekker)
 Forensisch onderzoek
 Authenticiteit levensmiddelen adhv DNA
 Authenticiteit levensmiddelen

1.2. Toepassingen




1.3. Ontdekking

 1983: PCR ontdekt door Kary Mullis
 1993: Nobelprijs scheikunde

, 1.4. Werking

 PCR: 1 cyclus
 Van 1 DNA kopie naar 2 kopieën
 PCR = kettingreactie
 Herhaling van de stappen
 30 a 40x cycli
 2-tal uur

1.4.1. Benodigdheden

 DNA template: bevat target DNA
 Primers: enkelstrengig of single-stranded (ssDNA) die target DNA afbakenen
 DNA polymerase: (vgl DNA replicatie), verlengen van keten
 Nucleotiden: (= dNTP’s) bouwstenen voor ketenverlenging
 Buffer
 Cycler: apparaat dat voor temperatuur schommelingen zorgt

1.4.2. 3 belangrijke stappen

 STAP 1 : denaturatie
 dsDNA (double stranded of dubbelstrengig) wijzigt in ssDNA zodat primers
kunnen hechten in volgende stap
 verhogen temperatuur tot 95°C mbv thermocyler

 STAP 2 : annealing (= hybridisatie)
 vasthechten van primers aan ssDNA
 Primers = ssDNA die target DNA afbakenen
 Telkens 2 primers = primerpaar: Forward primer & Reverse primer
 Temperatuur afhankelijk van primers 50 – 65°C

 STAP 3 : elongatie
 (= extension/ketenverlenging)
 nucleotiden worden ingebouwd om nieuwe (complementaire) DNA streng aan
te maken
 Temperatuursafhankelijk 70 – 74°C