samenvatting gel elektroforese

1. Gel elektroforese

 Scheiding van moleculen (DNA, RNA, EW) op basis van grootte
 Scheiding gedreven door de negatieve lading van moleculen
 Fosfaatgroep (-)
 Suiker
 Base
 O.i.v elektrisch veld bewegen moleculen richting pos pool door een gel
 = kathode (+) naar anode (-) (KNAP)

1.1. Eiwitten

 Eiwitscheiding m.B.v verticale elektroforese
 Gel = polyacrylamide
 Coomassie blauw bindt niet – specifiek aan = EW

1.2. DNA

 DNA gescheiden m.B.v horizontale elektroforese
 Gel = agarose
 Nancy of redsafe (vroeger ethidium bromide) of Diamond bindt specifiek aan DNA
voor visualisatie
 DNA in slots
 Elektrisch veld
 Migratie neg geladen DNA naar pos pool
 Visualisatie m.B.v fluorescente dye die bindt aan dsDNA en fluorisceert onder UV licht
 Stappenplan: methode en principe
 Aanmaak buffer
 Aanmaak agarose gel
 Laden gel
 Elektroforese
 DNA visualisatie

1.2.1. Aanmaak buffer

 TBE of TAE (2 – voddige beschermende functie voor DNA molecule)
 Trips = base Bufferwerking, licht alkalisch -> beschermt DNA
 Boorzuur of acetaat = zuur Tegen hydrolyse.
 EDTA blokkeert werking van DNase




1.2.2. Aanmaak agarose gel
1

,  Agarose = extract van zeewier (vergelijkbaar met gelatine)
 Moleculaire zeef
 Kleinere molecule bewegen sneller dan grotere moleculen
 Grootte DNA molecule uitgedrukt in bp
 Agarose poeder vermengen met buffer en opwarmen tot kookpunt
 Percentage gel kan aangetast worden
- Vb: 1% agarose gel = 1 g agar/100 ml buffer
 Keuze percentage gel hangt af van grootte te scheiden fragmenten
- Kleine frag = hoger percentage gel
- Grote frag = lage percentage gel
 Na opwarmen tot kookpunt van mengsel agarose en buffer
 Toevoegen fluorescente kleurstof
- Nancy
- Redsafe
- Diamond
- Vroeger ethidium -> zeer toxisch
 Na opwarming tot kookpunt van mengsel agarose en buffer
 Toevoegen fluoricente kleurstof
 Laten afkoelen tot handwarm
 Uitgieten in mal = gietvorm/matrijs
 Toevoegen slotkam -> slotje vormen
 Laten stollen/uitharden
 Kammetje verwijderen

1.2.3. Laden van de gel

 Pipetteren van DNA oplossing in slotje van de gel
 Gel in elektroforese toestel + TBE buffer (onderdompelen)
 DNA mengen met loading dye (= laadbuffer)
- Kleurstof: opvolgen pipetteren en elektroforese
- Glycerol: densiteit verhogen zodat DNA oplossing in slotje zakt
- EDTA: beschermen DNA tegen nucleases
 Hoe frag grootte bepalen na scheiding van frag?
 Pipetteer in 1e laantje DNA ladder = moleculaire merker
 Mengsel DNA fragmenten van gekende lengte worden meegelopen tijden
selektroforese
- = referentie waarmee te onderzoeken frag vergeleken kunnen worden




1.2.4. Elektroforese

2