H11. Elektroforese
1. Inleiding
Elektroforese = een scheidingstechniek voor biologische (macro)moleculen
= scheiding van deeltjes o.b.v. het feit dat ze een andere beweegsnelheid hebben in
een elektrisch veld
➔ Bv. om eiwitten, DNA en RNA van elkaar te scheiden
Voorwaarden vooraleer iets gaat bewegen in een elektrisch veld:
▪ Deeltjes moeten geladen zijn → zo niet, dan blijven ze stilstaan
▪ Grootte
▪ Vorm
Er zijn verschillende elektroforese opstellingen mogelijk:
• De verticale opstelling
- Het elektrisch veld staat verticaal
- O.a. voor het scheiden van eiwitten
• De horizontale opstelling
- Het elektrisch veld staat horizontaal
- O.a. om DNA te scheiden
• Capillaire elektroforese
- = Een systeem met hele dunne buisjes
- Het elektrisch veld wordt aangelegd over een heel dun buisje
- O.a. om de basenvolgorde van DNA te bepalen
• …
Elektroforeseopstellingen bevatten altijd:
▪ Een elektrisch veld
▪ Een bufferoplossing → vangt pH-schommelingen op
▪ Een elektroforsekamer
→ Er wordt vaak ook gebruik gemaakt van een matrix (= een gel waarin de stalen worden
aangebracht) wat zorgt voor een gecontroleerde elektroforese
Agarose gel en polyacrylamide gel zijn 2 vaak gebruikte gels
➔ Voordelen van gebruik van deze gels:
1. Minder diffusie van de aanwezige moleculen → zo ontstaan er na de elektroforese
mooi afgelijnde + te onderscheiden bandjes (betere resolutie)
2. Minder blootstelling van de stalen aan convectie (vloeistofstromen in de buffer)
→ Door convectie zal de resolutie van het eindresultaat slechter zijn
3. Je kan de stalen laden/aanbrengen op een welbepaald startpunt waardoor alle
stalen mooi op 1 zelfde lijn starten met bewegen
→ Nadien kan je de stalen onderling goed vergelijken
4. Gemakkelijke verwerking van het resultaat
→ Je kan je staal uit de elektroforesekamer halen om er bv. een foto van te nemen
(kan niet als je werkt in een vloeistof)
, Deeltjes worden gescheiden van elkaar omdat ze een verschillende migratiesnelheid hebben
→ De migratiesnelheid van de te scheiden moleculen stijgt als:
- De elektrische veldsterkte stijgt
- De nettolading van de moleculen stijgt
- De wrijving die de moleculen ondervinden daalt
Het elektrisch veld in een elektroforesekamer is een homogeen elektrisch veld
→ De elektrische veldsterkte wordt dus bepaald door:
▪ De spanning of potentiaal (V)
▪ De afstand tussen beide elektronen (d)
2. Migratiesnelheid
Er zijn 2 krachten die inwerken op een geladen deeltje:
1) Elektrische kracht Fq of Coulombkracht Fc
➢ = De kracht die het deeltje vooruit trekt in het elektrisch veld
➢ Is afhankelijk van:
- De grootte van de lading
- De grootte van de elektrische veldsterkte (E)
2) Wrijvingskracht Ff (friction) of Fw (wrijving)
➢ = De kracht die de voorwaartse beweging van het deeltje tegenwerkt
➢ Is afhankelijk van:
- De grootte van het deeltje
- De vorm van het deeltje*
- De densiteit/dichtheid van het medium
De viscositeit van het medium
- De temperatuur van het medium
*De vorm van moleculen heeft geen grote invloed op de migratiesnelheid van kleine moleculen
➔ De vorm wordt belangrijker bij grote moleculen (bv. DNA, vezeleiwitten, …)
𝑙 ➔ Bepaalt het effect van de vorm (van grote moleculen) op de migratiesnelheid
➔ De axiale ratio = ➔ l = lengte en b = breedte
𝑏
➔ Hoe groter de axiale ratio van een deeltje, hoe trager het deeltje beweegt
DNA is negatief geladen doordat er negatief geladen fosfaatgroepen in aanwezig zijn
➔ Open of relaxed DNA migreert trager door de gel dan supercoiled DNA
→ Dus relaxed DNA zal minder ver geraken dan supercoiled DNA
➔ Negatief stoot negatief af en positief trekt negatief aan
Voor bolvormige deeltjes:
➔ f = de wrijvingscoëfficiënt = 6 . π . η . r
➔ De wrijvingskracht Ff neemt toe als de snelheid van het deeltje toeneemt
1. Inleiding
Elektroforese = een scheidingstechniek voor biologische (macro)moleculen
= scheiding van deeltjes o.b.v. het feit dat ze een andere beweegsnelheid hebben in
een elektrisch veld
➔ Bv. om eiwitten, DNA en RNA van elkaar te scheiden
Voorwaarden vooraleer iets gaat bewegen in een elektrisch veld:
▪ Deeltjes moeten geladen zijn → zo niet, dan blijven ze stilstaan
▪ Grootte
▪ Vorm
Er zijn verschillende elektroforese opstellingen mogelijk:
• De verticale opstelling
- Het elektrisch veld staat verticaal
- O.a. voor het scheiden van eiwitten
• De horizontale opstelling
- Het elektrisch veld staat horizontaal
- O.a. om DNA te scheiden
• Capillaire elektroforese
- = Een systeem met hele dunne buisjes
- Het elektrisch veld wordt aangelegd over een heel dun buisje
- O.a. om de basenvolgorde van DNA te bepalen
• …
Elektroforeseopstellingen bevatten altijd:
▪ Een elektrisch veld
▪ Een bufferoplossing → vangt pH-schommelingen op
▪ Een elektroforsekamer
→ Er wordt vaak ook gebruik gemaakt van een matrix (= een gel waarin de stalen worden
aangebracht) wat zorgt voor een gecontroleerde elektroforese
Agarose gel en polyacrylamide gel zijn 2 vaak gebruikte gels
➔ Voordelen van gebruik van deze gels:
1. Minder diffusie van de aanwezige moleculen → zo ontstaan er na de elektroforese
mooi afgelijnde + te onderscheiden bandjes (betere resolutie)
2. Minder blootstelling van de stalen aan convectie (vloeistofstromen in de buffer)
→ Door convectie zal de resolutie van het eindresultaat slechter zijn
3. Je kan de stalen laden/aanbrengen op een welbepaald startpunt waardoor alle
stalen mooi op 1 zelfde lijn starten met bewegen
→ Nadien kan je de stalen onderling goed vergelijken
4. Gemakkelijke verwerking van het resultaat
→ Je kan je staal uit de elektroforesekamer halen om er bv. een foto van te nemen
(kan niet als je werkt in een vloeistof)
, Deeltjes worden gescheiden van elkaar omdat ze een verschillende migratiesnelheid hebben
→ De migratiesnelheid van de te scheiden moleculen stijgt als:
- De elektrische veldsterkte stijgt
- De nettolading van de moleculen stijgt
- De wrijving die de moleculen ondervinden daalt
Het elektrisch veld in een elektroforesekamer is een homogeen elektrisch veld
→ De elektrische veldsterkte wordt dus bepaald door:
▪ De spanning of potentiaal (V)
▪ De afstand tussen beide elektronen (d)
2. Migratiesnelheid
Er zijn 2 krachten die inwerken op een geladen deeltje:
1) Elektrische kracht Fq of Coulombkracht Fc
➢ = De kracht die het deeltje vooruit trekt in het elektrisch veld
➢ Is afhankelijk van:
- De grootte van de lading
- De grootte van de elektrische veldsterkte (E)
2) Wrijvingskracht Ff (friction) of Fw (wrijving)
➢ = De kracht die de voorwaartse beweging van het deeltje tegenwerkt
➢ Is afhankelijk van:
- De grootte van het deeltje
- De vorm van het deeltje*
- De densiteit/dichtheid van het medium
De viscositeit van het medium
- De temperatuur van het medium
*De vorm van moleculen heeft geen grote invloed op de migratiesnelheid van kleine moleculen
➔ De vorm wordt belangrijker bij grote moleculen (bv. DNA, vezeleiwitten, …)
𝑙 ➔ Bepaalt het effect van de vorm (van grote moleculen) op de migratiesnelheid
➔ De axiale ratio = ➔ l = lengte en b = breedte
𝑏
➔ Hoe groter de axiale ratio van een deeltje, hoe trager het deeltje beweegt
DNA is negatief geladen doordat er negatief geladen fosfaatgroepen in aanwezig zijn
➔ Open of relaxed DNA migreert trager door de gel dan supercoiled DNA
→ Dus relaxed DNA zal minder ver geraken dan supercoiled DNA
➔ Negatief stoot negatief af en positief trekt negatief aan
Voor bolvormige deeltjes:
➔ f = de wrijvingscoëfficiënt = 6 . π . η . r
➔ De wrijvingskracht Ff neemt toe als de snelheid van het deeltje toeneemt
