Hoofdstuk 1: DNA (p4 – 29)
1 Inleiding
1.1 Biochemische definities van leven
Voor definitie van ‘leven’ moet je gebruik maken van combinatie verschillende factoren (elke factor apart ook voor levenloze dingen):
− Afgescheiden: afgescheiden van leefomgeving door celmembraan/ celwand, inhoud (vooral H, O, C, N) verschillend van omgeving.
− Energieopname en energieverbruik: noodzakelijk voor instandhouding van organisme en voor de voortplanting.
− Groei: evolutie en complexiteit van organisme tot volwassen stadium, zal sterven door ouderdom of deling in dochterorganismen.
− Voortplanting: voortplanten door seksuele of aseksuele voortplanting, noodzakelijk om uitsterven te voorkomen.
− Beweging: kunnen op eigen kracht bewegen naar voedsel of energiebron (hoeft geen voortbewegen te zijn; zie planten)
− Interpretatie van prikkels: gegevens uit omgeving verzamelen en reageren op bepaalde condities
− Reageren/ communiceren: tussen soortgenoten maar ook tussen verschillende levensvormen (communiceren met omgeving)
1.2 Waaruit bestaat een levende cel?
De cel is basisstructuur van levende organismen dat min of meer autonoom in staat is te overleven. De cel is eenheid die afgescheiden
is van zijn omgeving en die bestaat uit een zeer georganiseerde opbouw die tot stand komt door wisselwerking tussen proteïnen, lipiden,
carbohydraten (koolwaterstoffen) en nucleïnezuren. Er bestaan twee basistypen van cellen: prokaryoten en eukaryoten. Eukaryote cellen
zijn opgedeeld in verschillende compartimenten door membranen, het duidelijkste is de celkern. Deze ontbreekt bij prokaryoten.
2 Historie erfelijkheidsleer
2.1 Eigenschappen zijn erfelijk: de genen
Genen zijn informatie bevattende elementen die karakteristieken van individu bevatten, maar ook van soort waartoe dit individu behoort,
daarmee coderen ze voor erfelijke eigenschappen. Genen werden voor het eerst gedefinieerd in studies van Mendel.
In Mendels experiment werden lange erwten met korte erwten gekruist en deze gaven in de eerste generatie uitsluitend lange erwten,
pas in de tweede kwamen terug korte voor. Mendel kwam tot volgende wetmatigheden:
1) Waarneembare eigenschappen zijn terug te brengen tot overerfbare eenheden.
2) Elke diploïde cel bevat 2 gekoppelde genen, waarbij eventueel meerdere allelen mogelijk zijn (elke variant van het gen).
3) Genen zijn óf dominant versus recessief (homozygoot) óf intermediair (heterozygoot).
2.2 Link tussen genen en biochemische processen door Garrod
Vervolgens legde Garrod link tussen genen en biochemische processen via zeldzame aandoening alkaptonurie. Het heeft uiteenlopende
symptomen maar bij baby’s met deze afwijking kleurt de urine, na enige tijd blootgesteld aan lucht, zwart. Hij was de eerste die voorstelde
dat deze ziekte te wijten was aan defect gen.
Hij beschreef alkaptonurie als een erfelijke veroorzaakte stofwisselingsziekte waarbij één defect gen één defect enzym oplevert omdat de
urine een hogere concentratie homogentisinezuur bevatte en dit moest normaal worden afgebroken door een enzym (dit was dan defect
bij alkaptonurie patiënten). Dit vormde de start van onderzoek naar moleculaire verklaring van erfelijkheid.
1
,2.3 Welke stoffen bevatten de genetische informatie?
2.3.1 Experimenteel onderzoeken
Door waarnemingen besloot men dat het waarschijnlijk de chromosomen zijn die de dragers zijn van de genetische info. Chromosomen
zijn draadvormige structuren die bestaan uit DNA en die drager zijn van de genen. Ze worden tijdens celdeling zichtbaar en deze worden
verdeeld over de twee dochtercellen.
Men moest experimenteel onderzoeken welke stoffen de genetische informatie bevatten, en hiervoor moest men de componenten van
de weefsels of cellen gaan scheiden:
1) Homogeniseren van cellen: detergent of mechanisch breken (mixer of ultrasoon geluid)
2) Filteren van homogenaat om de grote brokstukken te verwijderen.
3) De oplossing verdeling in fracties met behulp van ofwel een differentiële centrifugatie ofwel een densiteitscentrifugatie.
a. Differentiële ultracentrifugatie: homogenaat wordt lage rotatie-snelheid gecentrifugeerd, middelpuntvliedende kracht wordt
groter dan de zwaartekracht. De zwaarste celorganellen bevinden zich as eerste op bodem en vormen daar ‘pellet’, resterende
oplossing vormt het ‘supernatans’. Het pellet kan worden gescheiden van het supernatans en het supernatans kan opnieuw
gescheiden worden door een hoger toerental. Voor de scheiding van cytoplasma van de organellen heb je een rotatiesnelheid
nodig van 50.000 rpm.
b. Densiteitscentrifugatie: in centrifugebuis worden verschillende lagen met stijgende sucrose-concentratie aangebracht (er
zal geen homogeen mengsel ontstaan door densiteitsverschillen, onderaan bevindt zich hoogste concentratie). Hier boven
komt celhomogenaat en dit wordt gecentrifugeerd, de organellen migreren richting bodem totdat ze op laag zijn gekomen
waarin dichtheid gelijk is aan hun eigen densiteit. De opwaartse druk is hier gelijk aan neerwaartse, wat scheiding oplevert.
De scheiding kan ook verkregen worden door homogene oplossingen van CsCl (cesiumchloride) bij hoge rotatiesnelheden te
centrifugeren, omdat het CsCl naar de bodem zal zakken en er een concentratiegradiënt ontstaat. Dit wordt vaak gebruikt om
isotopen te scheiden: men kan dus bv. DNA met koolstof-12 scheiden van DNA met koolstof-14.
Voor Na
homogenaat
laagste sucrose gradiën t
Sucrosegradiënt
hoogste sucrose gradiënt
Voor Na
mengsel
homogene CsCl oplossing
CsCl gradiënt
12
C bevattend
14
C bevattend
2
,2.3.2 Experiment van Griffith
In experiment van Griffith werd gebruik gemaakt van S-stam (glad) en R-stam (onregelmatig) van bacterie streptococcus pneumoniae,
deze veroorzaakt een longontsteking. De volgende homogenaten werden ingespoten bij muis:
De S-stam injecteren → longontsteking
De R-stam injecteren → geen longontsteking
Verhitte S-stam injecteren → geen longontsteking
Een gehomogeniseerde S-stam + de R-stam → longontsteking: de R-stam nam het dodelijke deel van de S-stam over
Bacteriën konden genen uit de omgeving opnemen (= transformatie). Welke stof in S-substraat is hiervoor verantwoordelijk?
Griffith besloot S-homogenaat te scheiden in RNA, eiwitten, DNA, vetten en koolwaterstoffen. Bij alle 5 groepen werd R-stam toegevoegd
en deze R-stam werd ingespoten bij de muis. Hij vond dat alleen de muizen met DNA (afkomstig van S-homogenaat) een longontsteking
ontwikkelden. Dus groep met DNA kan R-stam transformeren naar S-vorm.
BESLUIT: Met dit experiment werd voor de eerste maal aangetoond dat DNA de erfelijke informatie (of genen) bevat.
2.3.3 Experiment Hershey-Chase
Worden de eigenschappen overgebracht door eiwitten of door DNA van de bacteriofagen?
Bacteriofagen zijn virussen van bacteriën, deze parasiteren op de bacterie en na de infectie komen er genen tot expressie in de bacterie
waardoor bacteriofaag-DNA wordt aangemaakt; de bacterie barst open en ontstaan nieuwe bacteriofagen.
Men bezat 2 culturen E. Coli die beiden werden besmet met bacteriofagen.
E. coli + fagen + zwavel-35 (kan enkel inbouwen in eiwitten): na schudden en centrifugeren van fagen met radioactief zwavel-35,
zag men dat het radioactief zwavel in de eiwitten werd ingebouwd en dus in het pellet zaten.
E. coli + fagen + fosfor-32 (kan enkel inbouwen in DNA): na schudden en centrifugeren van bacteriofagen met radioactief DNA, zag
men dat de fosfor-32 in het pellet zat en dus ingebouwd waren in het DNA.
WAARNEMING: Na centrifugatie kwamen bacteriën in pellet terecht en bacteriofagen in supernatans. Men zag dat het pellet radioactief
was door het fosfor (dus ook de bacteriën) terwijl het radioactief zwavel in het supernatans achterbleef.
BESLUIT: Het DNA (radioactief fosfaat) bevat de erfelijke informatie over de bouwstenen (zowel DNA als eiwitten) van de bacteriofagen.
3
,3 De structuur van DNA
3.1 Deoxyribonucleïnezuur
Examenvraag: Bespreek DNA.
DNA of deoxyribonucleïnezuur bestaat uit lange polymeren (1m DNA per menselijke cel) die zijn opgebouwd uit:
Deoxyribose (suiker): aan elkaar verbonden via fosfodiesterverbindingen: 5’-C via een fosfaatgroep met 3’-C van vorige.
Fosfaatgroepen: ribose en fosfaat wisselen elkaar af, de fosfaatgroepen zijn gekoppeld aan het 5’ uiteinde van het deoxyribose.
De 4 verschillende basen: adenine (A), guanine (G), cytosine (C) en thymine (T).
Purines: adenine en guanine; stikstof bevattende ringstructuur; komen in lage concentratie in cel voor.
Pyrimidines: thymine en cytosine; stikstof bevattende ringstructuur; komen in lage concentratie in cel voor.
Nucleoside = base verbonden aan deoxyribose via N-glycosidische binding: adenosine, cytidine, thymidine, guanosine, uridine. De
nucleosiden zijn beter oplosbaar in water in vergelijking met de basen.
Nucleotide = fosfaatgroep verbonden aan 5’-C van nucleoside. Deze komt meestal vrij voor in de cel. De synthese van nucleotiden
is mogelijk via 3 manieren: ofwel gewoon opbouwen, ofwel partiële hydrolyse van nucleïnezuren door nucleasen ofwel door afbraak
van vrijgekomen basen, ze kunnen door enzymatisch recuperatieproces omgezet worden tot nucleotiden.
Aan het 5’ C-atoom van de suiker kunnen maximaal 3 fosfaatgroepen worden gehangen via fosfo-anhydridebindingen tot vorming van
nucleotide-tri-fosfaten (NTPs). Hierin worden fosfaatgroepen achtereenvolgens aangeduid met α, β en γ, startend vanaf suikerring. β
en γ fosfaatgroepen kunnen worden afgesplitst door enzymen zonder andere bindingen te verbreken. NTPs zijn belangrijkste overdragers
van biochemische energie. Voorbeeld: ATP-ADP, ook andere kunnen ‘fosfaatenergie’ leveren aan biosynthetische reacties.
Ribose Deoxyribose
Adenine Guanine
Cytosine Thymine
4
, 3.1.1 Andere belangrijke basen en nucleotiden
Andere belangrijke:
1. cAMP (cyclisch adenosine monofosfaat): signaalmolecule, gesynthetiseerd door adenylaatcyclase (α-fosfaat ATP wordt verbonden
met 3’OH ribose), concentratie aan cAMP wordt bepaald door de enzymen die het aanmaken en de enzymen die het afbreken. Het
wordt afgebroken door het enzyme fosfodiësterase AMP (door hydrolyse van verbinding tussen fosfaat en 3’OH ribose).
2. Co-enzym A: betrokken bij acyltransferreacties.
3. NAD (nicotinamide adenine dinucleotide): betrokken met elektrontransferreacties.
4. FAD (flavin adenine dinucleotide): betrokken met elektrontransferreacties.
5. SAM (S-adenosylmethionine): dit is de methyldonor in verschillende methyleringen van basen en eiwitten.
6. Cafeïne: inhibitor fosfodiësterase (omzetting van cAMP naar AMP), hierdoor stijgt concentratie en werking van Camp en dit houdt
het organisme in geëxciteerde toestand.
7. AZT (3’-azido-2’-deoxythymidine): AIDS-remmer, het inhibeert het enzyme reverse-transcriptase van HIV-virus waardoor er minder
nieuwe virussen worden gevormd.
ATP en dATP Cyclisch AMP: adenylaat cyclase enzym: ATP → cAMP
AMP: knippen door fosfodiesterasen (PDE): cAMP → AMP SAM
Caffeine: gaan PDE binden zodat cAMP geen AMP kan worden AZT
5
1 Inleiding
1.1 Biochemische definities van leven
Voor definitie van ‘leven’ moet je gebruik maken van combinatie verschillende factoren (elke factor apart ook voor levenloze dingen):
− Afgescheiden: afgescheiden van leefomgeving door celmembraan/ celwand, inhoud (vooral H, O, C, N) verschillend van omgeving.
− Energieopname en energieverbruik: noodzakelijk voor instandhouding van organisme en voor de voortplanting.
− Groei: evolutie en complexiteit van organisme tot volwassen stadium, zal sterven door ouderdom of deling in dochterorganismen.
− Voortplanting: voortplanten door seksuele of aseksuele voortplanting, noodzakelijk om uitsterven te voorkomen.
− Beweging: kunnen op eigen kracht bewegen naar voedsel of energiebron (hoeft geen voortbewegen te zijn; zie planten)
− Interpretatie van prikkels: gegevens uit omgeving verzamelen en reageren op bepaalde condities
− Reageren/ communiceren: tussen soortgenoten maar ook tussen verschillende levensvormen (communiceren met omgeving)
1.2 Waaruit bestaat een levende cel?
De cel is basisstructuur van levende organismen dat min of meer autonoom in staat is te overleven. De cel is eenheid die afgescheiden
is van zijn omgeving en die bestaat uit een zeer georganiseerde opbouw die tot stand komt door wisselwerking tussen proteïnen, lipiden,
carbohydraten (koolwaterstoffen) en nucleïnezuren. Er bestaan twee basistypen van cellen: prokaryoten en eukaryoten. Eukaryote cellen
zijn opgedeeld in verschillende compartimenten door membranen, het duidelijkste is de celkern. Deze ontbreekt bij prokaryoten.
2 Historie erfelijkheidsleer
2.1 Eigenschappen zijn erfelijk: de genen
Genen zijn informatie bevattende elementen die karakteristieken van individu bevatten, maar ook van soort waartoe dit individu behoort,
daarmee coderen ze voor erfelijke eigenschappen. Genen werden voor het eerst gedefinieerd in studies van Mendel.
In Mendels experiment werden lange erwten met korte erwten gekruist en deze gaven in de eerste generatie uitsluitend lange erwten,
pas in de tweede kwamen terug korte voor. Mendel kwam tot volgende wetmatigheden:
1) Waarneembare eigenschappen zijn terug te brengen tot overerfbare eenheden.
2) Elke diploïde cel bevat 2 gekoppelde genen, waarbij eventueel meerdere allelen mogelijk zijn (elke variant van het gen).
3) Genen zijn óf dominant versus recessief (homozygoot) óf intermediair (heterozygoot).
2.2 Link tussen genen en biochemische processen door Garrod
Vervolgens legde Garrod link tussen genen en biochemische processen via zeldzame aandoening alkaptonurie. Het heeft uiteenlopende
symptomen maar bij baby’s met deze afwijking kleurt de urine, na enige tijd blootgesteld aan lucht, zwart. Hij was de eerste die voorstelde
dat deze ziekte te wijten was aan defect gen.
Hij beschreef alkaptonurie als een erfelijke veroorzaakte stofwisselingsziekte waarbij één defect gen één defect enzym oplevert omdat de
urine een hogere concentratie homogentisinezuur bevatte en dit moest normaal worden afgebroken door een enzym (dit was dan defect
bij alkaptonurie patiënten). Dit vormde de start van onderzoek naar moleculaire verklaring van erfelijkheid.
1
,2.3 Welke stoffen bevatten de genetische informatie?
2.3.1 Experimenteel onderzoeken
Door waarnemingen besloot men dat het waarschijnlijk de chromosomen zijn die de dragers zijn van de genetische info. Chromosomen
zijn draadvormige structuren die bestaan uit DNA en die drager zijn van de genen. Ze worden tijdens celdeling zichtbaar en deze worden
verdeeld over de twee dochtercellen.
Men moest experimenteel onderzoeken welke stoffen de genetische informatie bevatten, en hiervoor moest men de componenten van
de weefsels of cellen gaan scheiden:
1) Homogeniseren van cellen: detergent of mechanisch breken (mixer of ultrasoon geluid)
2) Filteren van homogenaat om de grote brokstukken te verwijderen.
3) De oplossing verdeling in fracties met behulp van ofwel een differentiële centrifugatie ofwel een densiteitscentrifugatie.
a. Differentiële ultracentrifugatie: homogenaat wordt lage rotatie-snelheid gecentrifugeerd, middelpuntvliedende kracht wordt
groter dan de zwaartekracht. De zwaarste celorganellen bevinden zich as eerste op bodem en vormen daar ‘pellet’, resterende
oplossing vormt het ‘supernatans’. Het pellet kan worden gescheiden van het supernatans en het supernatans kan opnieuw
gescheiden worden door een hoger toerental. Voor de scheiding van cytoplasma van de organellen heb je een rotatiesnelheid
nodig van 50.000 rpm.
b. Densiteitscentrifugatie: in centrifugebuis worden verschillende lagen met stijgende sucrose-concentratie aangebracht (er
zal geen homogeen mengsel ontstaan door densiteitsverschillen, onderaan bevindt zich hoogste concentratie). Hier boven
komt celhomogenaat en dit wordt gecentrifugeerd, de organellen migreren richting bodem totdat ze op laag zijn gekomen
waarin dichtheid gelijk is aan hun eigen densiteit. De opwaartse druk is hier gelijk aan neerwaartse, wat scheiding oplevert.
De scheiding kan ook verkregen worden door homogene oplossingen van CsCl (cesiumchloride) bij hoge rotatiesnelheden te
centrifugeren, omdat het CsCl naar de bodem zal zakken en er een concentratiegradiënt ontstaat. Dit wordt vaak gebruikt om
isotopen te scheiden: men kan dus bv. DNA met koolstof-12 scheiden van DNA met koolstof-14.
Voor Na
homogenaat
laagste sucrose gradiën t
Sucrosegradiënt
hoogste sucrose gradiënt
Voor Na
mengsel
homogene CsCl oplossing
CsCl gradiënt
12
C bevattend
14
C bevattend
2
,2.3.2 Experiment van Griffith
In experiment van Griffith werd gebruik gemaakt van S-stam (glad) en R-stam (onregelmatig) van bacterie streptococcus pneumoniae,
deze veroorzaakt een longontsteking. De volgende homogenaten werden ingespoten bij muis:
De S-stam injecteren → longontsteking
De R-stam injecteren → geen longontsteking
Verhitte S-stam injecteren → geen longontsteking
Een gehomogeniseerde S-stam + de R-stam → longontsteking: de R-stam nam het dodelijke deel van de S-stam over
Bacteriën konden genen uit de omgeving opnemen (= transformatie). Welke stof in S-substraat is hiervoor verantwoordelijk?
Griffith besloot S-homogenaat te scheiden in RNA, eiwitten, DNA, vetten en koolwaterstoffen. Bij alle 5 groepen werd R-stam toegevoegd
en deze R-stam werd ingespoten bij de muis. Hij vond dat alleen de muizen met DNA (afkomstig van S-homogenaat) een longontsteking
ontwikkelden. Dus groep met DNA kan R-stam transformeren naar S-vorm.
BESLUIT: Met dit experiment werd voor de eerste maal aangetoond dat DNA de erfelijke informatie (of genen) bevat.
2.3.3 Experiment Hershey-Chase
Worden de eigenschappen overgebracht door eiwitten of door DNA van de bacteriofagen?
Bacteriofagen zijn virussen van bacteriën, deze parasiteren op de bacterie en na de infectie komen er genen tot expressie in de bacterie
waardoor bacteriofaag-DNA wordt aangemaakt; de bacterie barst open en ontstaan nieuwe bacteriofagen.
Men bezat 2 culturen E. Coli die beiden werden besmet met bacteriofagen.
E. coli + fagen + zwavel-35 (kan enkel inbouwen in eiwitten): na schudden en centrifugeren van fagen met radioactief zwavel-35,
zag men dat het radioactief zwavel in de eiwitten werd ingebouwd en dus in het pellet zaten.
E. coli + fagen + fosfor-32 (kan enkel inbouwen in DNA): na schudden en centrifugeren van bacteriofagen met radioactief DNA, zag
men dat de fosfor-32 in het pellet zat en dus ingebouwd waren in het DNA.
WAARNEMING: Na centrifugatie kwamen bacteriën in pellet terecht en bacteriofagen in supernatans. Men zag dat het pellet radioactief
was door het fosfor (dus ook de bacteriën) terwijl het radioactief zwavel in het supernatans achterbleef.
BESLUIT: Het DNA (radioactief fosfaat) bevat de erfelijke informatie over de bouwstenen (zowel DNA als eiwitten) van de bacteriofagen.
3
,3 De structuur van DNA
3.1 Deoxyribonucleïnezuur
Examenvraag: Bespreek DNA.
DNA of deoxyribonucleïnezuur bestaat uit lange polymeren (1m DNA per menselijke cel) die zijn opgebouwd uit:
Deoxyribose (suiker): aan elkaar verbonden via fosfodiesterverbindingen: 5’-C via een fosfaatgroep met 3’-C van vorige.
Fosfaatgroepen: ribose en fosfaat wisselen elkaar af, de fosfaatgroepen zijn gekoppeld aan het 5’ uiteinde van het deoxyribose.
De 4 verschillende basen: adenine (A), guanine (G), cytosine (C) en thymine (T).
Purines: adenine en guanine; stikstof bevattende ringstructuur; komen in lage concentratie in cel voor.
Pyrimidines: thymine en cytosine; stikstof bevattende ringstructuur; komen in lage concentratie in cel voor.
Nucleoside = base verbonden aan deoxyribose via N-glycosidische binding: adenosine, cytidine, thymidine, guanosine, uridine. De
nucleosiden zijn beter oplosbaar in water in vergelijking met de basen.
Nucleotide = fosfaatgroep verbonden aan 5’-C van nucleoside. Deze komt meestal vrij voor in de cel. De synthese van nucleotiden
is mogelijk via 3 manieren: ofwel gewoon opbouwen, ofwel partiële hydrolyse van nucleïnezuren door nucleasen ofwel door afbraak
van vrijgekomen basen, ze kunnen door enzymatisch recuperatieproces omgezet worden tot nucleotiden.
Aan het 5’ C-atoom van de suiker kunnen maximaal 3 fosfaatgroepen worden gehangen via fosfo-anhydridebindingen tot vorming van
nucleotide-tri-fosfaten (NTPs). Hierin worden fosfaatgroepen achtereenvolgens aangeduid met α, β en γ, startend vanaf suikerring. β
en γ fosfaatgroepen kunnen worden afgesplitst door enzymen zonder andere bindingen te verbreken. NTPs zijn belangrijkste overdragers
van biochemische energie. Voorbeeld: ATP-ADP, ook andere kunnen ‘fosfaatenergie’ leveren aan biosynthetische reacties.
Ribose Deoxyribose
Adenine Guanine
Cytosine Thymine
4
, 3.1.1 Andere belangrijke basen en nucleotiden
Andere belangrijke:
1. cAMP (cyclisch adenosine monofosfaat): signaalmolecule, gesynthetiseerd door adenylaatcyclase (α-fosfaat ATP wordt verbonden
met 3’OH ribose), concentratie aan cAMP wordt bepaald door de enzymen die het aanmaken en de enzymen die het afbreken. Het
wordt afgebroken door het enzyme fosfodiësterase AMP (door hydrolyse van verbinding tussen fosfaat en 3’OH ribose).
2. Co-enzym A: betrokken bij acyltransferreacties.
3. NAD (nicotinamide adenine dinucleotide): betrokken met elektrontransferreacties.
4. FAD (flavin adenine dinucleotide): betrokken met elektrontransferreacties.
5. SAM (S-adenosylmethionine): dit is de methyldonor in verschillende methyleringen van basen en eiwitten.
6. Cafeïne: inhibitor fosfodiësterase (omzetting van cAMP naar AMP), hierdoor stijgt concentratie en werking van Camp en dit houdt
het organisme in geëxciteerde toestand.
7. AZT (3’-azido-2’-deoxythymidine): AIDS-remmer, het inhibeert het enzyme reverse-transcriptase van HIV-virus waardoor er minder
nieuwe virussen worden gevormd.
ATP en dATP Cyclisch AMP: adenylaat cyclase enzym: ATP → cAMP
AMP: knippen door fosfodiesterasen (PDE): cAMP → AMP SAM
Caffeine: gaan PDE binden zodat cAMP geen AMP kan worden AZT
5
