Thema 6 - DNA: replicatie, foutenherstel en recombinatie
Verschillen in DNA kunnen de variaties produceren die ten grondslag liggen aan de
verschillen tussen individuen van dezelfde soort, zelfs binnen dezelfde familie.
In de loop van de evolutionaire tijd geven deze genetische veranderingen aanleiding tot de
verschillen die de ene soort van de andere onderscheiden.
- Ondanks de systemen voor fouten in het kopiëren van DNA tegen te gaan, kunnen er
mutaties optreden. Deze kunnen goed, slecht of neutraal zijn voor de cel!
DNA replicatie:
-> Volledig genoom wordt gekopieerd
-> ‘ouder’-DNA streng fungeert als matrijs
-> Aanmaak van complementaire DNA streng
-> Nucleotide A-T en G-C
Twee DNA strengen kunnen elk als sjabloon
gebruikt worden aangezien ze complementair zijn.
Produceren van twee identieke dubbele DNA
helixen en is semi-conservatief.
Drie mogelijke modellen voor replicatie:
1. Semi Conservatief: nieuwe streng gaat paren met ouder streng
2. Dispersief: in stukjes aan elkaar geplakt, twee nieuwe dubbelstrengen
3. Conservatief: ouderstreng terug basenparen en nieuwe streng ook apart, volledig
nieuwe en oude
Scheiding van zware en lichte DNA moleculen tijdens centrifugatie:
-> In een cesium chloride gradient.
-> Bacteriën worden gedurende meerdere generaties gekweekt in een medium dat ofwel
zware isotoop of lichte isotoop bevat om hun DNA te labelen.
-> Cellen worden vervolgens opengebroken en het DNA wordt in een ultracentrifuge buis
geladen die een cesium chloride zoutoplossing bevat.
-> Op hoge snelheid gebracht -> om cesium chloride een gradiënt te laten vormen met een
lage dichtheid aan de bovenkant en hoge dichtheid aan de onderkant.
=> DNA-replicatie is "semi conservatief" omdat elke dubbele DNA-helix van dochter is
samengesteld uit één geconserveerde (oude) streng en één nieuw gesynthetiseerde streng.
,Beginpunt van replicatie:
Dubbele DNA-helix wordt geopend bij replicatie oorsprong.
DNA-sequenties op replicatie oorsprong worden herkend door initiator
eiwitten, die plaatselijk de twee strengen van de dubbele helix uit elkaar
trekken (replicatievorken).
Blootgestelde enkele strengen kunnen dienen als sjablonen voor het
kopiëren van het DNA.
Replicatie start op plaatsen die AT rijk zijn -> twee waterstofbruggen,
minder energie nodig.
Replicatievorken:
- Bewegen in tegengestelde richtingen.
- Typisch voor eukaryoten: duizende replicatie origines -> veel replicaties tegelijk
(prokaryoten: slechts één replicatie origine )
Aanhechting van nieuw nucleotide:
-> Aan 3’-uiteinde
-> Nieuwe DNA-streng wordt gesynthetiseerd in de 5’ naar 3’ richting.
-> Vraagt veel energie:
- Synthese van RNA of DNA is een meerstapsproces dat wordt aangedragen door
ATP hydrolyse:
1. Nucleoside Monofosfaat wordt geactiveerd door de opeenvolgende
overdracht van de terminale fosfaatgroepen van twee ATP-moleculen.
2. Gevormde hoogenergetische tussenproduct bestaat vrij in oplossing totdat
het reageert met groeiende uiteinde van een RNA of DNA keten (waarbij
pyrofosfaat vrijkomt)
3. Hydrolyse van pyrofosfaat tot anorganisch fosfaat is zeer gunstig + helpt
algehele reactie in de richting van polynucleotide synthese te sturen.
, DNA-polymerase:
- Voegt een deoxyribonucleotide toe aan het 3’ uiteinde van een groeiende
DNA-streng.
- Binnenkomend nucleotide trifosfaat vormt een basenpaar met zijn partner in de
matrijsstreng.
- Wordt covalent gehecht aan het vrije 3’ hydroxy op de groeiende DNA-streng.
-> Nieuwe streng gaat daarom van 5’ naar 3’ (maar in één richting groeien).
- Energie voor de polymerisatiereactie komt van de hydrolyse van hoogenergetische
fosfaatbinding in het binnenkomende nucleotide trifosfaat en de afgifte van
pyrofosfaat (dat vervolgens gehydrolyseerd wordt om twee moleculen anorganisch
fosfaat op te leveren)
-> Reactie wordt gekatalyseerd door het enzym DNA-polymerase
-> Leidt het binnenkomende nucleotide trifosfaat naar de matrijsstreng en positioneert het
zodanig dat zijn 5'-trifosfaat kan reageren met de 3'-hydroxylgroep op de nieuw
gesynthetiseerde streng.
Replicatievorken zijn asymmetrisch:
3’ - 5’ streng (leidende streng) laat continue synthese toe.
5’ - 3’ streng (navolgende streng) geen continue synthese,
maar synthese van kleine fragmentjes,
Okazaki-fragmenten, die daarna aan elkaar geplakt
worden.
DNA-polymerase bevat aparte plaatsen voor
DNA-synthese en proeflezen:
- 2 actieve sites:
1. ‘P’ : aanhechten van nieuwe nucleotide (polymerisatie)
2. ‘E’: correctie (endonuclease-activiteit) van verkeerd nucleotide
- Wanneer de polymerase een onjuist nucleotide toevoegt, ontkoppelt de nieuw
gesynthetiseerde DNA-streng tijdelijk van de sjabloon streng -> het 3'-uiteinde
beweegt naar de bewerkingsplaats (E) om het onjuiste nucleotide te kunnen
verwijderen.
Verschillen in DNA kunnen de variaties produceren die ten grondslag liggen aan de
verschillen tussen individuen van dezelfde soort, zelfs binnen dezelfde familie.
In de loop van de evolutionaire tijd geven deze genetische veranderingen aanleiding tot de
verschillen die de ene soort van de andere onderscheiden.
- Ondanks de systemen voor fouten in het kopiëren van DNA tegen te gaan, kunnen er
mutaties optreden. Deze kunnen goed, slecht of neutraal zijn voor de cel!
DNA replicatie:
-> Volledig genoom wordt gekopieerd
-> ‘ouder’-DNA streng fungeert als matrijs
-> Aanmaak van complementaire DNA streng
-> Nucleotide A-T en G-C
Twee DNA strengen kunnen elk als sjabloon
gebruikt worden aangezien ze complementair zijn.
Produceren van twee identieke dubbele DNA
helixen en is semi-conservatief.
Drie mogelijke modellen voor replicatie:
1. Semi Conservatief: nieuwe streng gaat paren met ouder streng
2. Dispersief: in stukjes aan elkaar geplakt, twee nieuwe dubbelstrengen
3. Conservatief: ouderstreng terug basenparen en nieuwe streng ook apart, volledig
nieuwe en oude
Scheiding van zware en lichte DNA moleculen tijdens centrifugatie:
-> In een cesium chloride gradient.
-> Bacteriën worden gedurende meerdere generaties gekweekt in een medium dat ofwel
zware isotoop of lichte isotoop bevat om hun DNA te labelen.
-> Cellen worden vervolgens opengebroken en het DNA wordt in een ultracentrifuge buis
geladen die een cesium chloride zoutoplossing bevat.
-> Op hoge snelheid gebracht -> om cesium chloride een gradiënt te laten vormen met een
lage dichtheid aan de bovenkant en hoge dichtheid aan de onderkant.
=> DNA-replicatie is "semi conservatief" omdat elke dubbele DNA-helix van dochter is
samengesteld uit één geconserveerde (oude) streng en één nieuw gesynthetiseerde streng.
,Beginpunt van replicatie:
Dubbele DNA-helix wordt geopend bij replicatie oorsprong.
DNA-sequenties op replicatie oorsprong worden herkend door initiator
eiwitten, die plaatselijk de twee strengen van de dubbele helix uit elkaar
trekken (replicatievorken).
Blootgestelde enkele strengen kunnen dienen als sjablonen voor het
kopiëren van het DNA.
Replicatie start op plaatsen die AT rijk zijn -> twee waterstofbruggen,
minder energie nodig.
Replicatievorken:
- Bewegen in tegengestelde richtingen.
- Typisch voor eukaryoten: duizende replicatie origines -> veel replicaties tegelijk
(prokaryoten: slechts één replicatie origine )
Aanhechting van nieuw nucleotide:
-> Aan 3’-uiteinde
-> Nieuwe DNA-streng wordt gesynthetiseerd in de 5’ naar 3’ richting.
-> Vraagt veel energie:
- Synthese van RNA of DNA is een meerstapsproces dat wordt aangedragen door
ATP hydrolyse:
1. Nucleoside Monofosfaat wordt geactiveerd door de opeenvolgende
overdracht van de terminale fosfaatgroepen van twee ATP-moleculen.
2. Gevormde hoogenergetische tussenproduct bestaat vrij in oplossing totdat
het reageert met groeiende uiteinde van een RNA of DNA keten (waarbij
pyrofosfaat vrijkomt)
3. Hydrolyse van pyrofosfaat tot anorganisch fosfaat is zeer gunstig + helpt
algehele reactie in de richting van polynucleotide synthese te sturen.
, DNA-polymerase:
- Voegt een deoxyribonucleotide toe aan het 3’ uiteinde van een groeiende
DNA-streng.
- Binnenkomend nucleotide trifosfaat vormt een basenpaar met zijn partner in de
matrijsstreng.
- Wordt covalent gehecht aan het vrije 3’ hydroxy op de groeiende DNA-streng.
-> Nieuwe streng gaat daarom van 5’ naar 3’ (maar in één richting groeien).
- Energie voor de polymerisatiereactie komt van de hydrolyse van hoogenergetische
fosfaatbinding in het binnenkomende nucleotide trifosfaat en de afgifte van
pyrofosfaat (dat vervolgens gehydrolyseerd wordt om twee moleculen anorganisch
fosfaat op te leveren)
-> Reactie wordt gekatalyseerd door het enzym DNA-polymerase
-> Leidt het binnenkomende nucleotide trifosfaat naar de matrijsstreng en positioneert het
zodanig dat zijn 5'-trifosfaat kan reageren met de 3'-hydroxylgroep op de nieuw
gesynthetiseerde streng.
Replicatievorken zijn asymmetrisch:
3’ - 5’ streng (leidende streng) laat continue synthese toe.
5’ - 3’ streng (navolgende streng) geen continue synthese,
maar synthese van kleine fragmentjes,
Okazaki-fragmenten, die daarna aan elkaar geplakt
worden.
DNA-polymerase bevat aparte plaatsen voor
DNA-synthese en proeflezen:
- 2 actieve sites:
1. ‘P’ : aanhechten van nieuwe nucleotide (polymerisatie)
2. ‘E’: correctie (endonuclease-activiteit) van verkeerd nucleotide
- Wanneer de polymerase een onjuist nucleotide toevoegt, ontkoppelt de nieuw
gesynthetiseerde DNA-streng tijdelijk van de sjabloon streng -> het 3'-uiteinde
beweegt naar de bewerkingsplaats (E) om het onjuiste nucleotide te kunnen
verwijderen.
