Hoofdstuk 1: Inleiding tot de Moleculaire Biologie
Het centrale dogma:
= genetische informatie kan overgedragen worden van
nucleïnezuren (DNA) naar eiwitten
Replicatie = DNA wordt gekopieerd
• Mitose = cel niveau
• Meiose = niveau van individu
Transcriptie = matrijs van DNA wordt afgeschreven in mRNA
Translatie = mRNA wordt vertaald naar een eiwitsequentie
(3letter-code)
● cDNA = copy DNA
● Retrotranscriptie = dmv het retrotranscriptase kan RNA terug worden omgezet in cDNA, dit is NIET aanwezig
in de mens (vaak in retorvirussen)
● Prionen = abnormaal gevouwen eiwitten die hun slechte eigenschap kunnen doorgeven op gezonde eiwitten
(prionenziekte)
● tRNA = leest mRNA af en voegt aminozuren toe aan de groeiende proteïneketen
De cel
Groot verschil tussen prokaryoot / eukaryoot:
• prokaryoot:
o alle processen vinden tegelijk plaats in de cel en in dezelfde ruimte
o alle cellen binnen 1 soort zijn identiek
• eukaryoot:
o aanwezigheid van een celkern
o moleculaire processen zijn gescheiden in tijd en ruimte
o heterogeniteit van de cellen in vorm en functie (door differentiatie)
Nucleïnezuren
De proef van Griffith
Experimenten met de pathogene Streptococcus pneumoniae in muizen
• twee bacteriestammen
o R-stam Niet virulent
o S-stam virulent door een polysachariden-kapsel dat fagocytose voorkomt
OPM= polysacharide-kapsel in het centrale dogma: het DNA van de S-stam bevat een gen dat codeert voor een
enzym voor de aanmaak van het polysacharidekapsel
• De muizen gingen niet dood door een DODE S-stam
• Mengsel van dode S-stam en levende R-stam zorgde voor ziektesymptomen
1
, o Genetische informatie werd doorgegeven van de S op de R stam waardoor deze ook het
kapsel ontwikkelde
De proef van Hersey en Chase
Bestudeerde bacteriofagen, virussen van bacteriën
• Radio-actieve isotopen om DNA met 32P of eiwitten met 35S te labelen
• Virussen injecteren hun genetisch materiaal in de bacterie
• De bacteriën bevatten het genetische materiaal van de bacteriofagen en enkel het gelabelde DNA
met 32P werd teruggevonden , wat wil zeggen dat enkel het DNA wordt doorgegeven en niet de
eiwitten zelf
DNA (deoxyribonucleïnezuur)
De bouwstenen:
● 4 verschillende HETEROCYCLISCHE stikstofhoudende basen + deoxyribose + fosfaat
● De purines adenine (A) en guanine (G) (bestaan uit 2 carbonringen)
● De pyrimidines cytosine (C) en thymine (T) (bestaan uit 1 carbonring)
●
Waterstofbruggen:
● 2 H-bruggen tussen A-T (minder sterk dus DNA zal hiertussen geknipt worden)
● 3 H-bruggen tussen C-G
● A-T en C-G zijn complementaire basen --> meest stabiele combinaties
● Volledig molecule = nucleotiden (ook wel de dNTPs genoemd)
● Base + ribose = nucleoside
o C1-atoom gebonden aan het stikstofatoom = glycosidische binding
● dNTP = deoxynucleoside 5’- trifosfaat
De fosfodiësterbinding:
● 1 fosfaat gebonden aan 2 suikers via esterbindingen
● 5’-uiteinde met fosfaatgroep (=begin van molecule)
● 3’-uiteinde met hydroxylgroep (=einde van molecule)
Fosfodiësterbinding tussen -H van 3’ en -P van 5’
= de cel hangt aan het 3’ telkens een nieuwe dNTP
Vb: enkelstrengig DNA-molecule kan als primer worden gebruikt. Het
is een synthetisch aangemaakt oligonucleotide
Basen-ambiguïteit = een mengsel van DNA-moleculen wordt
gesequenct, soms komt een A voor en soms een G op die plaats in de
sequentie. Het is afhankelijk van de persoon
2
,De dubbele helix:
• De regel van Chargaff = DNA-moleculen bevatten steeds 50% purines en 50% pyrimidines, DNA
bezit een regelmatige structuur
• DNA-molecule bestaat uit:
o Een dubbele helix, Spiraalsgewijs gewonden om een gemeenschappelijke as
o 1 complete winding = 10 nucleotide en 34A
o Diameter van de helix is 20A
o Oriëntatie van de ketens is anti-parallel
o Basen naar het centrum georiënteerd (base-pare stacking)
Topoisomerase:
● = enzymen die gebieden ontwinden als er tijdens replicatie/transcriptie/recombinatie superwindingen
(overwindingen) ontstaane
▪ Superwindingen = helix windt zichzelf extra op
▪ Helix kan niet sterker opwinden dan 10 basenparen per winding
▪ Superwindingen kunnen tot breuk leiden
● Semi-conservatieve replicatie = er ontstaan dubbele helixen, identiek aan de oorspronkelijke, met elk 1
ouderstreng en 1 dochterstreng
● Type I-topoisomerasen: induceren een enkelstrengs breuk in de DNA keten
▪ Dan gaat intacte keten tussen de uiteinden van de breuk
▪ De breuk wordt geligeerd
▪ Resultaat: DNA met 1 winding minder dan de originele helix
● Type II-topoisomerasen: ontwinden superwindingen
▪ Breken fosfodiësterbindingen in beide ketens
▪ Andere dubbelhelix kan nu door de breuk
Synthese van oligonucleotiden:
● = korte nucleïnezuurfragmenten (primers) tot 200 nucleotiden door chemische synthese
● Synthese altijd van 3’ naar 5’
OPM: tegengesteld aan de richting van de nucleïnezuursynthese door DNA polymerase
● Telkens als een nieuwe nucleotide is toegevoegd = 1 cyclus
● Bouwstenen:
▪ DNT-groep op 5’: alle functionele groepen zijn geblokkeerd met beschermende groepen tegen
nevenreacties
▪ Als de keten lang genoeg is, worden de beschermende groepen verwijderd
Voor de reactie:
● 3’ verbonden op een vaste drager ---> blijft zo gehecht en reagentia kunnen erover vloeien
● Fosfodiësterbinding aan 5’ ipv 3’
● Proces is NIET exponentieel
3
, 1 synthetische cyclus bestaat uit:
1. De-blokkering: DMT-groep verwijderd door zure
hydrolyse --> vrije 5’-OH-groep
2. Koppeling: geblokkeerd nucleotide toegevoegd -- >
fosfiet triësterbinding met 5’-OH-groep
3. Capping: niet gereageerde 5’-OH-groepen moeten
permanent geblokkeerd worden -> anders krijg je
interen basendeleties na het doorlopen van alle
synthetische cycli
4. Stabilisatie: stabiliseren van oligonucleotide door
oxidatie of sulfurisatie
5. Finaal: losmaken van dragermedium +
beschermende groepen loskoppelen
Polymerase chain reaction (PCR)
• Altijd 3 opeenvolgende stappen in 1 cyclus
o Denaturatie: DNA wordt enkelstrengig
o Annealing: binden van de primers
o Elongatie: verlengen van de ketens (hoe groter het gewenste fragment, hoe langer de stap
duurt)
• Reagentia:
o Primers: specifiek voor het gewenste fragment
o Taq polymerase: nucleotide toevoegen
o dNTPs: bouwstenen
o Template DNA: staal
o Aangepaste buffer
DNA sequencing:
DNA sequencing volgens Sanger:
Principe = primer wordt radio-actief gelabeld waardoor elk
nieuw fragment ook gelabeld is
4 verschillende proefbuizen, in elke proefbuis zijn alle dNTPs
aanwezig MAAR maar 1 soort ddNTP (stopnucleotide). Het
laatste nucleotide kan dus enkel het stopcodon zijn
Adhv gelelektroforese worden de fragmenten op basis van
grootte gescheiden van elkaar en kan de sequentie worden
afgelezen van onder naar boven (omdat onderaan de kortste
fragmenten zitten op de gel)
4
Het centrale dogma:
= genetische informatie kan overgedragen worden van
nucleïnezuren (DNA) naar eiwitten
Replicatie = DNA wordt gekopieerd
• Mitose = cel niveau
• Meiose = niveau van individu
Transcriptie = matrijs van DNA wordt afgeschreven in mRNA
Translatie = mRNA wordt vertaald naar een eiwitsequentie
(3letter-code)
● cDNA = copy DNA
● Retrotranscriptie = dmv het retrotranscriptase kan RNA terug worden omgezet in cDNA, dit is NIET aanwezig
in de mens (vaak in retorvirussen)
● Prionen = abnormaal gevouwen eiwitten die hun slechte eigenschap kunnen doorgeven op gezonde eiwitten
(prionenziekte)
● tRNA = leest mRNA af en voegt aminozuren toe aan de groeiende proteïneketen
De cel
Groot verschil tussen prokaryoot / eukaryoot:
• prokaryoot:
o alle processen vinden tegelijk plaats in de cel en in dezelfde ruimte
o alle cellen binnen 1 soort zijn identiek
• eukaryoot:
o aanwezigheid van een celkern
o moleculaire processen zijn gescheiden in tijd en ruimte
o heterogeniteit van de cellen in vorm en functie (door differentiatie)
Nucleïnezuren
De proef van Griffith
Experimenten met de pathogene Streptococcus pneumoniae in muizen
• twee bacteriestammen
o R-stam Niet virulent
o S-stam virulent door een polysachariden-kapsel dat fagocytose voorkomt
OPM= polysacharide-kapsel in het centrale dogma: het DNA van de S-stam bevat een gen dat codeert voor een
enzym voor de aanmaak van het polysacharidekapsel
• De muizen gingen niet dood door een DODE S-stam
• Mengsel van dode S-stam en levende R-stam zorgde voor ziektesymptomen
1
, o Genetische informatie werd doorgegeven van de S op de R stam waardoor deze ook het
kapsel ontwikkelde
De proef van Hersey en Chase
Bestudeerde bacteriofagen, virussen van bacteriën
• Radio-actieve isotopen om DNA met 32P of eiwitten met 35S te labelen
• Virussen injecteren hun genetisch materiaal in de bacterie
• De bacteriën bevatten het genetische materiaal van de bacteriofagen en enkel het gelabelde DNA
met 32P werd teruggevonden , wat wil zeggen dat enkel het DNA wordt doorgegeven en niet de
eiwitten zelf
DNA (deoxyribonucleïnezuur)
De bouwstenen:
● 4 verschillende HETEROCYCLISCHE stikstofhoudende basen + deoxyribose + fosfaat
● De purines adenine (A) en guanine (G) (bestaan uit 2 carbonringen)
● De pyrimidines cytosine (C) en thymine (T) (bestaan uit 1 carbonring)
●
Waterstofbruggen:
● 2 H-bruggen tussen A-T (minder sterk dus DNA zal hiertussen geknipt worden)
● 3 H-bruggen tussen C-G
● A-T en C-G zijn complementaire basen --> meest stabiele combinaties
● Volledig molecule = nucleotiden (ook wel de dNTPs genoemd)
● Base + ribose = nucleoside
o C1-atoom gebonden aan het stikstofatoom = glycosidische binding
● dNTP = deoxynucleoside 5’- trifosfaat
De fosfodiësterbinding:
● 1 fosfaat gebonden aan 2 suikers via esterbindingen
● 5’-uiteinde met fosfaatgroep (=begin van molecule)
● 3’-uiteinde met hydroxylgroep (=einde van molecule)
Fosfodiësterbinding tussen -H van 3’ en -P van 5’
= de cel hangt aan het 3’ telkens een nieuwe dNTP
Vb: enkelstrengig DNA-molecule kan als primer worden gebruikt. Het
is een synthetisch aangemaakt oligonucleotide
Basen-ambiguïteit = een mengsel van DNA-moleculen wordt
gesequenct, soms komt een A voor en soms een G op die plaats in de
sequentie. Het is afhankelijk van de persoon
2
,De dubbele helix:
• De regel van Chargaff = DNA-moleculen bevatten steeds 50% purines en 50% pyrimidines, DNA
bezit een regelmatige structuur
• DNA-molecule bestaat uit:
o Een dubbele helix, Spiraalsgewijs gewonden om een gemeenschappelijke as
o 1 complete winding = 10 nucleotide en 34A
o Diameter van de helix is 20A
o Oriëntatie van de ketens is anti-parallel
o Basen naar het centrum georiënteerd (base-pare stacking)
Topoisomerase:
● = enzymen die gebieden ontwinden als er tijdens replicatie/transcriptie/recombinatie superwindingen
(overwindingen) ontstaane
▪ Superwindingen = helix windt zichzelf extra op
▪ Helix kan niet sterker opwinden dan 10 basenparen per winding
▪ Superwindingen kunnen tot breuk leiden
● Semi-conservatieve replicatie = er ontstaan dubbele helixen, identiek aan de oorspronkelijke, met elk 1
ouderstreng en 1 dochterstreng
● Type I-topoisomerasen: induceren een enkelstrengs breuk in de DNA keten
▪ Dan gaat intacte keten tussen de uiteinden van de breuk
▪ De breuk wordt geligeerd
▪ Resultaat: DNA met 1 winding minder dan de originele helix
● Type II-topoisomerasen: ontwinden superwindingen
▪ Breken fosfodiësterbindingen in beide ketens
▪ Andere dubbelhelix kan nu door de breuk
Synthese van oligonucleotiden:
● = korte nucleïnezuurfragmenten (primers) tot 200 nucleotiden door chemische synthese
● Synthese altijd van 3’ naar 5’
OPM: tegengesteld aan de richting van de nucleïnezuursynthese door DNA polymerase
● Telkens als een nieuwe nucleotide is toegevoegd = 1 cyclus
● Bouwstenen:
▪ DNT-groep op 5’: alle functionele groepen zijn geblokkeerd met beschermende groepen tegen
nevenreacties
▪ Als de keten lang genoeg is, worden de beschermende groepen verwijderd
Voor de reactie:
● 3’ verbonden op een vaste drager ---> blijft zo gehecht en reagentia kunnen erover vloeien
● Fosfodiësterbinding aan 5’ ipv 3’
● Proces is NIET exponentieel
3
, 1 synthetische cyclus bestaat uit:
1. De-blokkering: DMT-groep verwijderd door zure
hydrolyse --> vrije 5’-OH-groep
2. Koppeling: geblokkeerd nucleotide toegevoegd -- >
fosfiet triësterbinding met 5’-OH-groep
3. Capping: niet gereageerde 5’-OH-groepen moeten
permanent geblokkeerd worden -> anders krijg je
interen basendeleties na het doorlopen van alle
synthetische cycli
4. Stabilisatie: stabiliseren van oligonucleotide door
oxidatie of sulfurisatie
5. Finaal: losmaken van dragermedium +
beschermende groepen loskoppelen
Polymerase chain reaction (PCR)
• Altijd 3 opeenvolgende stappen in 1 cyclus
o Denaturatie: DNA wordt enkelstrengig
o Annealing: binden van de primers
o Elongatie: verlengen van de ketens (hoe groter het gewenste fragment, hoe langer de stap
duurt)
• Reagentia:
o Primers: specifiek voor het gewenste fragment
o Taq polymerase: nucleotide toevoegen
o dNTPs: bouwstenen
o Template DNA: staal
o Aangepaste buffer
DNA sequencing:
DNA sequencing volgens Sanger:
Principe = primer wordt radio-actief gelabeld waardoor elk
nieuw fragment ook gelabeld is
4 verschillende proefbuizen, in elke proefbuis zijn alle dNTPs
aanwezig MAAR maar 1 soort ddNTP (stopnucleotide). Het
laatste nucleotide kan dus enkel het stopcodon zijn
Adhv gelelektroforese worden de fragmenten op basis van
grootte gescheiden van elkaar en kan de sequentie worden
afgelezen van onder naar boven (omdat onderaan de kortste
fragmenten zitten op de gel)
4
