Gentechnologie - 003923
Examinatie Vragen
2021-2022
Part 0: Introductie : Prokaryoten
1. Wat is de gemiddelde grootte van eukaryote cellen, prokaryote cellen en virussen ?
Prokaryoten: 1 µm tot 3 µm
Eukaryoten: 10 µm tot 100 µm
Virussen: 5 nm tot 100 nm
2. Teken de algemene organisatie van de wand van Gram-positieve en Gram-negatieve
bacteriën met de namen van de verschillende componenten.
Grampositief: dikke laag peptidoglycaan en plasmamembraan, behouden paarse gramkleuring.
Gramnegatief: dunnere laag peptidoglycaan, 2 membranen: binnen- en buitenmembraan, ruimte tussen
membranen = periplasma (bevat peptidoglycaan), vaak resistenter tegen antibiotica.
3. Waarom werd de bacterie Escherichia coli veel gebruikt voor genetische manipulatie ?
E. coli is goed gekarakteriseerd op genetisch en biochemische niveau (→ moleculaire tools kunnen
ontwikkeld worden om ze gemakkelijk te manipuleren), groeit heel snel (20 minuten voor deling) en het
genoom is volledig gesequeneerd, verklaard en gekarakteriseerd.
1
, 4. Wat is peptidoglycaan, wat zijn zijn subeenheden en waar is het in de bacteriële wand ?
Peptidoglycaan = polysacharidelaag gevormd door 2 subeenheden die verbonden zijn door een
peptidebrug en die helpt bij het beschermen tegen de extracellulaire omgeving en zorgt voor
vormbehoud van de bacterie. Bestaat uit β (1 → 4) linked N-acetylglucosamine (GlcNAc of NAG) en N-
acetylmuramic acid (MurNAc of NAM) glycan.
In gramnegatieve bacteriën bevindt het zich tussen het binnen- en buitenmembraan in het periplasma.
5. Wat is de lipopolysaccharide, wat zijn zijn subeenheden en waar is het in de bacteriële wand?
LPS = component dat verankerd zit aan buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën. De structuur is
belangrijk voor bv labelen van proteïnen van het buitenmembraan en technieken zoals immunokleuring.
Bestaat uit lipid A, intern deel, extern deel en O-antigen (wordt herkend door ons immuunsysteem).
In LPS zijn verschillende negatieve ladingen die worden gestabiliseerd door kationen zoals Mg2+ (kunnen
voor experiment worden verwijderd door EDTA → - worden niet gestabiliseerd en stoten elkaar af).
6. Wat is, met betrekking tot lipopolysaccharide, het mogelijke nadeel van het gebruik van
bacteriën voor de productie van proteïnen van medisch belang ?
LPS (= lipopolysacharide, component van bacteriële celwand) bevat een O-antigen dat kan worden
herkend door het immuunsysteem. Daarom kan het gebruik van bacteriën om proteïnen voor mensen en
dieren te produceren nadelig of zelfs gevaarlijk zijn, omdat er een grote immuunreactie tot gevolg kan
zijn.
2
, Part 1: Prokaryoten: Plasmids and chromosome, selection and counter-selection
markers
7. Noem twee belangrijke verschillen tussen een bacterieel chromosoom en een
bacterieelplasmide.
Bacterieel chromosoom Bacterieel plasmide
Bevat zowel essentiële als niet-essentiële Bevat enkel niet-essentiële genen →
genen. selectiedruk om te worden behouden
Groter Kleiner
Hebben geen origin of replication Hebben origin of replication
Hebben geen selectiemarkers Hebben selectiemarkers (bv
antibioticaresistentie)
8. Geef de definitie van een bacterieel chromosoom en plasmide.
Bacterieel chromosoom = grote circulaire molecule dat in cytoplasma van bacteriën wordt gevonden. Het
bevat zowel essentiële (A gene is essential if we cannot delete it in a rich culture medium. It is therefore
essential for the survival of the bacteria under the tested conditions) als niet-essentiële (A virulence factor
only affects the infection capabilities of a pathogenic bacterium. It is not an essential gene because we
can remove it and the bacteria will survive under rich conditions, it will just be less virulent under infection
context. genen en kan 1 mm lang zijn.
Bacterieel plasmide = DNA-molecule dat een oorsprong van replicatie heeft en dat niet essentieel is om
te overleven onder gedefinieerde groeiomstandigheden.
9. Teken de algemene organisatie van een plasmide en noem de verschillende componenten.
Deze tekening geeft de organisatie van een algemeen plasmide weer met resistentiesites tegen antibiotica,
promotors voor genexpressie, 1 origin of replication voor replicatie en overdraging naar dochtercellen en
verschillende restrictiesites.
3
, Multiple cloning site = DNA-regio in eenzelfde plasmide dat meerdere verschillende unieke restrictiesites
bevat (vergemakkelijkt het klonen van een locatie).
10. Noem drie gevolgen van het hebben van de ene specifieke oorsprong van replicatie boven
de andere.
➔ Incompatibility = onvermogen van 2 plasmiden om stabiel naast elkaar te bestaan gedurende
een aantal generzties in dezelfde bacteriële cellijn. Verschillende plasmiden met dezelfde origin
of replication binnen eenzelfde cel zijn incompatibel
➔ Bepaling host range: Plasmide kan repliceren binnen bepaalde stammen, maar dan weer niet in
andere → rekening mee houden tijdens kiezen voor integratie van plasmide.
➔ Bepaling copy number (aantal kopieën van een plasmide per cel): Voor genetische manipulatie
is het gemakkelijker om met plasmiden met een hoog copy number te werken (makkelijker te
zuiveren, want moeten minder geconcentreerd worden dus er komen minder onzuiverheden in
eppendorf).
11. Leg uit waarom sommige plasmiden incompatibel zijn. Leg de verschillende criteria uit.
Soms zijn plasmiden incompatibel met elkaar, omdat ze bij replicatie niet zonder problemen kunnen
worden gescheiden. Dit komt omdat de plasmiden dezelfde ORI hebben of dicht aan elkaar verwant zijn.
Dan gaan er tijdens replicatie foute plasmide-paren worden gevormd waardoor foute polymerisatie
gebeurt van eiwitten die gekoppeld zijn aan elk van de plasmiden en ze dus niet kunnen worden
gescheiden en ieder in een dochtercel terechtkomen.
12. Leg uit waarom plasmiden met dezelfde oorsprong van replicatie incompatibel zijn.
Replicatie van een plasmide wordt geïnitieerd door keuze van 1 of meerdere willekeurige plasmiden om
replicatie te initiëren. Stel plasmide A en B hebben dezelfde ORI. Als A wordt geselecteerd voor replicatie
van een ouderlijke cel dan is A waarschijnlijker geselecteerd door 1 van de 2 dochtercellen. In generatie
2 is er heel hoge kans dat A wordt gerepliceerd ipv B (en 100% in de andere, die geen B heeft gekregen).
Zo zal binnen enkele generaties B bijna volledig verdwijnen.
13. Is het mogelijk om de aanwezigheid van verschillende plasmiden op een stabiele manier
in dezelfde bacterie te hebben?
4
Examinatie Vragen
2021-2022
Part 0: Introductie : Prokaryoten
1. Wat is de gemiddelde grootte van eukaryote cellen, prokaryote cellen en virussen ?
Prokaryoten: 1 µm tot 3 µm
Eukaryoten: 10 µm tot 100 µm
Virussen: 5 nm tot 100 nm
2. Teken de algemene organisatie van de wand van Gram-positieve en Gram-negatieve
bacteriën met de namen van de verschillende componenten.
Grampositief: dikke laag peptidoglycaan en plasmamembraan, behouden paarse gramkleuring.
Gramnegatief: dunnere laag peptidoglycaan, 2 membranen: binnen- en buitenmembraan, ruimte tussen
membranen = periplasma (bevat peptidoglycaan), vaak resistenter tegen antibiotica.
3. Waarom werd de bacterie Escherichia coli veel gebruikt voor genetische manipulatie ?
E. coli is goed gekarakteriseerd op genetisch en biochemische niveau (→ moleculaire tools kunnen
ontwikkeld worden om ze gemakkelijk te manipuleren), groeit heel snel (20 minuten voor deling) en het
genoom is volledig gesequeneerd, verklaard en gekarakteriseerd.
1
, 4. Wat is peptidoglycaan, wat zijn zijn subeenheden en waar is het in de bacteriële wand ?
Peptidoglycaan = polysacharidelaag gevormd door 2 subeenheden die verbonden zijn door een
peptidebrug en die helpt bij het beschermen tegen de extracellulaire omgeving en zorgt voor
vormbehoud van de bacterie. Bestaat uit β (1 → 4) linked N-acetylglucosamine (GlcNAc of NAG) en N-
acetylmuramic acid (MurNAc of NAM) glycan.
In gramnegatieve bacteriën bevindt het zich tussen het binnen- en buitenmembraan in het periplasma.
5. Wat is de lipopolysaccharide, wat zijn zijn subeenheden en waar is het in de bacteriële wand?
LPS = component dat verankerd zit aan buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën. De structuur is
belangrijk voor bv labelen van proteïnen van het buitenmembraan en technieken zoals immunokleuring.
Bestaat uit lipid A, intern deel, extern deel en O-antigen (wordt herkend door ons immuunsysteem).
In LPS zijn verschillende negatieve ladingen die worden gestabiliseerd door kationen zoals Mg2+ (kunnen
voor experiment worden verwijderd door EDTA → - worden niet gestabiliseerd en stoten elkaar af).
6. Wat is, met betrekking tot lipopolysaccharide, het mogelijke nadeel van het gebruik van
bacteriën voor de productie van proteïnen van medisch belang ?
LPS (= lipopolysacharide, component van bacteriële celwand) bevat een O-antigen dat kan worden
herkend door het immuunsysteem. Daarom kan het gebruik van bacteriën om proteïnen voor mensen en
dieren te produceren nadelig of zelfs gevaarlijk zijn, omdat er een grote immuunreactie tot gevolg kan
zijn.
2
, Part 1: Prokaryoten: Plasmids and chromosome, selection and counter-selection
markers
7. Noem twee belangrijke verschillen tussen een bacterieel chromosoom en een
bacterieelplasmide.
Bacterieel chromosoom Bacterieel plasmide
Bevat zowel essentiële als niet-essentiële Bevat enkel niet-essentiële genen →
genen. selectiedruk om te worden behouden
Groter Kleiner
Hebben geen origin of replication Hebben origin of replication
Hebben geen selectiemarkers Hebben selectiemarkers (bv
antibioticaresistentie)
8. Geef de definitie van een bacterieel chromosoom en plasmide.
Bacterieel chromosoom = grote circulaire molecule dat in cytoplasma van bacteriën wordt gevonden. Het
bevat zowel essentiële (A gene is essential if we cannot delete it in a rich culture medium. It is therefore
essential for the survival of the bacteria under the tested conditions) als niet-essentiële (A virulence factor
only affects the infection capabilities of a pathogenic bacterium. It is not an essential gene because we
can remove it and the bacteria will survive under rich conditions, it will just be less virulent under infection
context. genen en kan 1 mm lang zijn.
Bacterieel plasmide = DNA-molecule dat een oorsprong van replicatie heeft en dat niet essentieel is om
te overleven onder gedefinieerde groeiomstandigheden.
9. Teken de algemene organisatie van een plasmide en noem de verschillende componenten.
Deze tekening geeft de organisatie van een algemeen plasmide weer met resistentiesites tegen antibiotica,
promotors voor genexpressie, 1 origin of replication voor replicatie en overdraging naar dochtercellen en
verschillende restrictiesites.
3
, Multiple cloning site = DNA-regio in eenzelfde plasmide dat meerdere verschillende unieke restrictiesites
bevat (vergemakkelijkt het klonen van een locatie).
10. Noem drie gevolgen van het hebben van de ene specifieke oorsprong van replicatie boven
de andere.
➔ Incompatibility = onvermogen van 2 plasmiden om stabiel naast elkaar te bestaan gedurende
een aantal generzties in dezelfde bacteriële cellijn. Verschillende plasmiden met dezelfde origin
of replication binnen eenzelfde cel zijn incompatibel
➔ Bepaling host range: Plasmide kan repliceren binnen bepaalde stammen, maar dan weer niet in
andere → rekening mee houden tijdens kiezen voor integratie van plasmide.
➔ Bepaling copy number (aantal kopieën van een plasmide per cel): Voor genetische manipulatie
is het gemakkelijker om met plasmiden met een hoog copy number te werken (makkelijker te
zuiveren, want moeten minder geconcentreerd worden dus er komen minder onzuiverheden in
eppendorf).
11. Leg uit waarom sommige plasmiden incompatibel zijn. Leg de verschillende criteria uit.
Soms zijn plasmiden incompatibel met elkaar, omdat ze bij replicatie niet zonder problemen kunnen
worden gescheiden. Dit komt omdat de plasmiden dezelfde ORI hebben of dicht aan elkaar verwant zijn.
Dan gaan er tijdens replicatie foute plasmide-paren worden gevormd waardoor foute polymerisatie
gebeurt van eiwitten die gekoppeld zijn aan elk van de plasmiden en ze dus niet kunnen worden
gescheiden en ieder in een dochtercel terechtkomen.
12. Leg uit waarom plasmiden met dezelfde oorsprong van replicatie incompatibel zijn.
Replicatie van een plasmide wordt geïnitieerd door keuze van 1 of meerdere willekeurige plasmiden om
replicatie te initiëren. Stel plasmide A en B hebben dezelfde ORI. Als A wordt geselecteerd voor replicatie
van een ouderlijke cel dan is A waarschijnlijker geselecteerd door 1 van de 2 dochtercellen. In generatie
2 is er heel hoge kans dat A wordt gerepliceerd ipv B (en 100% in de andere, die geen B heeft gekregen).
Zo zal binnen enkele generaties B bijna volledig verdwijnen.
13. Is het mogelijk om de aanwezigheid van verschillende plasmiden op een stabiele manier
in dezelfde bacterie te hebben?
4
