1
2.4.1: ISOLEREN VAN EIWITTEN Serine of threonine fosfatasen Natrium fluoride
Natrium pyrofosfaat
- starmateriaal homogeniseren → ruw eiwitlysaat
Tyrosine fosfatasen Natrium orthovanadaat
- samenstelling homogenisatiebuffer voor eiwit:
▪ Buffer: pH ▪ Mengsel van meerdere protease-inhibitoren in buffer
▪ Zout: niet denatureert & oplost ▪ Bekomen van ruw eiwitlysaat → verder opzuiveren via:
▪ Protease inhibitoren: niet afbreekt o chromatografie
▪ Fosfatase inhibitoren: fosforylaties geconserveerd blijven o Elektroforese
▪ Detergent: oplossen celmembraanReducerend agens: breken
disulfidebruggen
2.4.2: AANMAAK VAN EIWITTEN
a) protease inhibitoren:
- doel:
Protease familie Protease inhibitoren
Serineproteasen PMSF 1) Wetenschappelijk onderzoek
→ Als serine essentieel is voor katalytische activiteit Benzamidine 2) Farmaceutische industrie
aprotinine 3) Waspoederindustrie
Metalloproteasen EDTA ( binden aan 4) Voedingsindustrie
→metaalionen nodig voor katalytische activiteit metaalionen)
CHEMISCHE SYNTHESE IN VITRO
Cysteïne proteasen Leupeptine
→cysteïne essentieel voor katalytische activiteit - Voordelen:
Aspartaat proteasen Pepstatine ▪ Synthese artificiële eiwitten
→aspartaat essentieel voor katalytische activiteit ▪ Geen problemen toxiciteit organismen
- Nadelen:
▪ Mengsel van meerdere protease-inhibitoren in buffer ▪ duur
▪ Met of zonder EDTA ▪ Kleine #
▪ Per cyclus:
b) fosfatase inhibitoren: o Opbrengst verlagen extra AZ
Fosfatasefamilie Fosfatase inhibitoren o Enkel korte sequenties
o Toepassingen:
, 2
▪ Aanmaak peptiden voor antistoffen ▪ vaak koppelen aan in vitro transcriptie, translatie
▪ Aanmaak artificiële eiwitten ▪ toepassingen:
o karakteriseren van ORF
Synthese van eiwitten door koppelen van peptiden:
o structurele & functionele studies
* einde van peptide linker:
- reactieve groep
IN VIVO EXPRESSIE SYSTEMEN
- reageert enkel met carboxygroep van AZ
▪ expressie van recombinant eiwit komt:
* beschermingsgroepen reacties voorkomen: o na introductie recombinant DNA
= recombinante eiwitproductie
- groen ~ N terminus bescherming
▪ Gekozen organisme:
- rood ~ bescherming zijketens o Bepaalt keuze expressie van plasmide & sequentie
* vrijzittende aminogroep reactie carboxygroep 2e AZ
Codon optimisatie:
* alle AZ ingebouwd:
o Wat:
- klievingsreactie: eiwit losmaken van peptide linker
▪ aanpassen eiwitcoderende DNA sequentie
o waarom:
▪ hogere eiwitexpressie
ENZYMATISCHE SYNTHESE IN VITRO
o waar:
▪ gebruik van reticulocyt ▪ codons waarvoor veel tRNA’s aanwezig zijn
o immature RBC o voorbeeld arganine als codon:
o bevat ribosomen ▪ 22%: AGA human sequentie
o bevat AZ en E ▪ 1 %: AGA E. Coli
o heeft sterk eiwittranslatiemechanisme → E. coli weinig tRNA
o gespecialiseerde aanmaak → moeilijk uit arginine een eiwit bouwen
→ codon optimalisatie nodig
, 3
Transiënte eiwitproductie Stabiele eiwitproductie ▪ PTM:
Transfectie van DNA Transductie van DNA o Bepaald structuur & functionaliteit
= DNA integreert NIET in genoom gastheercel = DNA integreert WEL in genoom ▪ Aggregaten/ inclusion bodies:
Gastcel delen → recombinant verdund Subcultuur aanwezig = slecht gestructureerde eiwitten
Duur: enkele dagen Duur: maanden o Voordelen:
▪ Geen last toxiciteit voor bacterie
▪ Beschermd van proteolyse
▪ Zuiver & hoog geconcentreerd eiwit
IPTG inductie
▪ Laboratoriumschaal vs. Industriële schaal Lac repressor binden op T7.
Kleine volumes grotere volumes ( tanken)
Hierdoor geen transcriptie of
translatie.
Expressiesystemen IPTG bindt Lac repressor & neem
af T7. Hierdoor kan T7 RNA
1) Bacteriële expressiesystemen polymerase binden & translatie
▪ E. Coli: plaatsvinden
o vaak gebruikt
o Bacterie: kapot voor eiwitsecretatie
▪ Bacillus subtilis: Artificiële bacteriële ribosomen ( Ribo-T)
o Eiwitsecretie in medium
o Bacterie: niet kapot voor eiwitsecretatie ▪ Witte ribosoom:
o mRNA transleren voor eiwitaanmaak
▪ Gekleurde ribosoom:
o extra artificiële ribosoom
o Ribo-T: zet kleine & grote SE aan elkaar
o andere Shine-Dalgarno sequentie herkennen:
2.4.1: ISOLEREN VAN EIWITTEN Serine of threonine fosfatasen Natrium fluoride
Natrium pyrofosfaat
- starmateriaal homogeniseren → ruw eiwitlysaat
Tyrosine fosfatasen Natrium orthovanadaat
- samenstelling homogenisatiebuffer voor eiwit:
▪ Buffer: pH ▪ Mengsel van meerdere protease-inhibitoren in buffer
▪ Zout: niet denatureert & oplost ▪ Bekomen van ruw eiwitlysaat → verder opzuiveren via:
▪ Protease inhibitoren: niet afbreekt o chromatografie
▪ Fosfatase inhibitoren: fosforylaties geconserveerd blijven o Elektroforese
▪ Detergent: oplossen celmembraanReducerend agens: breken
disulfidebruggen
2.4.2: AANMAAK VAN EIWITTEN
a) protease inhibitoren:
- doel:
Protease familie Protease inhibitoren
Serineproteasen PMSF 1) Wetenschappelijk onderzoek
→ Als serine essentieel is voor katalytische activiteit Benzamidine 2) Farmaceutische industrie
aprotinine 3) Waspoederindustrie
Metalloproteasen EDTA ( binden aan 4) Voedingsindustrie
→metaalionen nodig voor katalytische activiteit metaalionen)
CHEMISCHE SYNTHESE IN VITRO
Cysteïne proteasen Leupeptine
→cysteïne essentieel voor katalytische activiteit - Voordelen:
Aspartaat proteasen Pepstatine ▪ Synthese artificiële eiwitten
→aspartaat essentieel voor katalytische activiteit ▪ Geen problemen toxiciteit organismen
- Nadelen:
▪ Mengsel van meerdere protease-inhibitoren in buffer ▪ duur
▪ Met of zonder EDTA ▪ Kleine #
▪ Per cyclus:
b) fosfatase inhibitoren: o Opbrengst verlagen extra AZ
Fosfatasefamilie Fosfatase inhibitoren o Enkel korte sequenties
o Toepassingen:
, 2
▪ Aanmaak peptiden voor antistoffen ▪ vaak koppelen aan in vitro transcriptie, translatie
▪ Aanmaak artificiële eiwitten ▪ toepassingen:
o karakteriseren van ORF
Synthese van eiwitten door koppelen van peptiden:
o structurele & functionele studies
* einde van peptide linker:
- reactieve groep
IN VIVO EXPRESSIE SYSTEMEN
- reageert enkel met carboxygroep van AZ
▪ expressie van recombinant eiwit komt:
* beschermingsgroepen reacties voorkomen: o na introductie recombinant DNA
= recombinante eiwitproductie
- groen ~ N terminus bescherming
▪ Gekozen organisme:
- rood ~ bescherming zijketens o Bepaalt keuze expressie van plasmide & sequentie
* vrijzittende aminogroep reactie carboxygroep 2e AZ
Codon optimisatie:
* alle AZ ingebouwd:
o Wat:
- klievingsreactie: eiwit losmaken van peptide linker
▪ aanpassen eiwitcoderende DNA sequentie
o waarom:
▪ hogere eiwitexpressie
ENZYMATISCHE SYNTHESE IN VITRO
o waar:
▪ gebruik van reticulocyt ▪ codons waarvoor veel tRNA’s aanwezig zijn
o immature RBC o voorbeeld arganine als codon:
o bevat ribosomen ▪ 22%: AGA human sequentie
o bevat AZ en E ▪ 1 %: AGA E. Coli
o heeft sterk eiwittranslatiemechanisme → E. coli weinig tRNA
o gespecialiseerde aanmaak → moeilijk uit arginine een eiwit bouwen
→ codon optimalisatie nodig
, 3
Transiënte eiwitproductie Stabiele eiwitproductie ▪ PTM:
Transfectie van DNA Transductie van DNA o Bepaald structuur & functionaliteit
= DNA integreert NIET in genoom gastheercel = DNA integreert WEL in genoom ▪ Aggregaten/ inclusion bodies:
Gastcel delen → recombinant verdund Subcultuur aanwezig = slecht gestructureerde eiwitten
Duur: enkele dagen Duur: maanden o Voordelen:
▪ Geen last toxiciteit voor bacterie
▪ Beschermd van proteolyse
▪ Zuiver & hoog geconcentreerd eiwit
IPTG inductie
▪ Laboratoriumschaal vs. Industriële schaal Lac repressor binden op T7.
Kleine volumes grotere volumes ( tanken)
Hierdoor geen transcriptie of
translatie.
Expressiesystemen IPTG bindt Lac repressor & neem
af T7. Hierdoor kan T7 RNA
1) Bacteriële expressiesystemen polymerase binden & translatie
▪ E. Coli: plaatsvinden
o vaak gebruikt
o Bacterie: kapot voor eiwitsecretatie
▪ Bacillus subtilis: Artificiële bacteriële ribosomen ( Ribo-T)
o Eiwitsecretie in medium
o Bacterie: niet kapot voor eiwitsecretatie ▪ Witte ribosoom:
o mRNA transleren voor eiwitaanmaak
▪ Gekleurde ribosoom:
o extra artificiële ribosoom
o Ribo-T: zet kleine & grote SE aan elkaar
o andere Shine-Dalgarno sequentie herkennen:
