Inleiding tot de biotechnologie
en genetica
Inleiding
Biotechnologie = het gebruik en manipulatie van biologische systemen ter (industriële) bereiding van
natuurlijke grondstoffen en biomassa.
Biologische systemen zijn ook enzymen geïsoleerd uit levende wezens.
bv. Enzymen toevoegen aan reactievat om zo DNA over te schrijven naar RNA.
Veeteelt biotechnologie
Biotechnologie al duizenden jaren onbewust gebruikt (gebruik bacteriën en gisten vr productie
levensmiddelen)
L. Pasteur micro-organismen zijn verantwoordelijk voor bepaalde chemische omzettingen.
Fermentatie
Synoniem voor gisting. Dit is de afbraak van organische stof zonder tussenkomst van zuurstof
(anaeroob).
Tweede periode
- Introductie industriële processen vr aanmaak: glycol, butanol, aceton en citroenzuur
- Massaproductie bakkersgist
- Biologische zuiveringsinstallaties
Niet verhinderd door vreemde micro-organismen
Derde periode
- Aseptische technieken zuivere culturen (aseptisch = zuiver, tegengaan van besmetting)
- Farmaceutische productie penicilline.
Vierde periode
- Invoer van recombinant DNA-technieken = genetic engeneering
- Doorbraak plantaardige en dierlijke celculturen in productieprocessen
Farmaceutische wereld:
Noodzaak massaproductie oraal werkzame antimicrobiële stoffen ontwikkeling van:
- Kiemverbetering
- Industriële aseptische technieken
DNA-manipuleren => op industriële schaal proteïnen aanmaken. (neuro-endocriene boodschappers,
lymfokines, bloedproteïnen)
Recombinante technieken => productie vaccins, monoklonale antilichamen en enzymen.
Biologicals biotechnologische producten
!! heel belangrijk om adhv analyse de eindproducten te controleren op contaminaties!!
1
,Hoofdstuk II: basisbegrippen/technieken in biotechnologie en geneti ca
II.1 DNA RNA
1. DNA-structuur
Primaire structuur = polynucleotidestructuur (onstaat door 3’-5’ fosfordiëster verbindingen tussen
nucleotiden suiker-fosfaatskelet)
Secundaire structuur = 2 anti-paralelle ketens = Watson en Crick model.
- Dubbelstrengig
- H-bruggen tussen complementaire basen (A-T en C-G) houden ketens samen.
purines
- Chargaffrel regel: =1
pyridines
- Purines (A en G)
- Pyridines (C en T)
Virussen: mogelijkheid tot vormen van haarspeldstructuren door complementariteit met zichzelf.
Bacteriële genomen, sommige virussen, bacteriofagen en plasmiden: bevatten circulaire DNA
moleculen.
2. Denaturatie-renaturatie
Reversibel proces:
- Denaturatie
oorzaken: thermisch (verwarmen), pH wijzigingen, destabillisatie (ureum of formamide)
- Tm waarde/smelttemperatuur: temp waarbij de helft van de basen ongepaard is. Neemt toe
bij meer GC baseparen. 3 H bruggen ipv 2 bij een AT bp.
- Renaturatie: bij een temp die 25°C lager ligt dan de Tm.
UV spectrofotometrie:
gebruikt bij de meting of detectie van
denaturatie.
DS DNA bij 260nm: lagere absorbantie
SS DNA bij 260nm: hogere absorbantie
bepaling van de zuiverheid van DNA
OD 260
- Zuiver DNA = =1,8
OD 280
- Zie extra document in geval van
onzuiverheden.
schatting van de hoeveelheid DNA
Renaturatie:
Homologe renaturatie Heterologe renaturatie
Volledig complementair stuk identiek DNA, Geen volledige complementariteit, er ontstaan
renaturatie tot exact dezelfde DS als ervoor. mismatches.
Kationen lagere afstoting (neg dna) Tm is 1,4°C lager per mismatch.
hogere Tm
2
, 3. DNA-replicatie
Eigenschappen:
- 50 basen per seconde
- DNA-polymerase
- Deoxyribonucleotide trifosfaten
- Semi-conservatief
- Assymetrische replicatievork leading en
lagging strand
- Bestaande DNA-streng als template
Origin of replication: DNA-sequentie van ongeveer 300 basen lang (AT-rijk), hier ontstaan 2
replicatievorken. (links en rechts)
ontstaan van de replicatievork: (katalytische reacties)
DNA helicase bindt op initiator proteïnen die op de origin of replication binden.
Single-strand DNA-binding proteins (SSB): eiwitten die de gevormde enkelstrengen stabiel houden.
Ringvormig eiwit helpt DNA-polymerase op de streng te binden.
DNA-polymerase
- Proof-reading activiteit: fouten herstellen of voorkomen tijdens het overschrijven. = 5’-3’ – 5’
exonuclease-activiteit
- Lagging strand: okazaki fragmenten
- Synthese wWerking: 5’-3’-richting
- Primers!
DNA-primase: eiwit die zorgt voor de aanmaak van RNAprimers van 10 basen.
DNA-primase: 5’-3’ richting
3’-OH uiteinde primers GEEN mismatch!
De additionele 5’-3’ exonuclease activiteit zal RNA stukje van het vooliggend okazaki
fragment verwijderen. (zie slide)
DNA-ligase: zorgt voor de uiteindelijke verbinding van de okazakifragmenten.
Primosoom: multiproteïnecomplex verantwoordelijk voor de start van de replicatie. Helicase +
Primase.
II.2 de polymerase chain reacti on of PCR
1. Principe van de PCR reactie
Analyse van genen = naald in een hooiberg, veel naalden maken maakt het gemakkelijker om er te
vinden, dus enorme hoeveelheid kopieën gemaakt van deze naalden of genen = PCR.
PCR
- Template = enkelstrengig DNA
- DNA replicatie
- Denaturatie verhitten tot 94°C
- 2 primers nodig (werking polymerase); Primers wijzen met 3’ uiteinde naar elkaar
- 5’-3’ richting
- Annealing primers = renaturatie
3
en genetica
Inleiding
Biotechnologie = het gebruik en manipulatie van biologische systemen ter (industriële) bereiding van
natuurlijke grondstoffen en biomassa.
Biologische systemen zijn ook enzymen geïsoleerd uit levende wezens.
bv. Enzymen toevoegen aan reactievat om zo DNA over te schrijven naar RNA.
Veeteelt biotechnologie
Biotechnologie al duizenden jaren onbewust gebruikt (gebruik bacteriën en gisten vr productie
levensmiddelen)
L. Pasteur micro-organismen zijn verantwoordelijk voor bepaalde chemische omzettingen.
Fermentatie
Synoniem voor gisting. Dit is de afbraak van organische stof zonder tussenkomst van zuurstof
(anaeroob).
Tweede periode
- Introductie industriële processen vr aanmaak: glycol, butanol, aceton en citroenzuur
- Massaproductie bakkersgist
- Biologische zuiveringsinstallaties
Niet verhinderd door vreemde micro-organismen
Derde periode
- Aseptische technieken zuivere culturen (aseptisch = zuiver, tegengaan van besmetting)
- Farmaceutische productie penicilline.
Vierde periode
- Invoer van recombinant DNA-technieken = genetic engeneering
- Doorbraak plantaardige en dierlijke celculturen in productieprocessen
Farmaceutische wereld:
Noodzaak massaproductie oraal werkzame antimicrobiële stoffen ontwikkeling van:
- Kiemverbetering
- Industriële aseptische technieken
DNA-manipuleren => op industriële schaal proteïnen aanmaken. (neuro-endocriene boodschappers,
lymfokines, bloedproteïnen)
Recombinante technieken => productie vaccins, monoklonale antilichamen en enzymen.
Biologicals biotechnologische producten
!! heel belangrijk om adhv analyse de eindproducten te controleren op contaminaties!!
1
,Hoofdstuk II: basisbegrippen/technieken in biotechnologie en geneti ca
II.1 DNA RNA
1. DNA-structuur
Primaire structuur = polynucleotidestructuur (onstaat door 3’-5’ fosfordiëster verbindingen tussen
nucleotiden suiker-fosfaatskelet)
Secundaire structuur = 2 anti-paralelle ketens = Watson en Crick model.
- Dubbelstrengig
- H-bruggen tussen complementaire basen (A-T en C-G) houden ketens samen.
purines
- Chargaffrel regel: =1
pyridines
- Purines (A en G)
- Pyridines (C en T)
Virussen: mogelijkheid tot vormen van haarspeldstructuren door complementariteit met zichzelf.
Bacteriële genomen, sommige virussen, bacteriofagen en plasmiden: bevatten circulaire DNA
moleculen.
2. Denaturatie-renaturatie
Reversibel proces:
- Denaturatie
oorzaken: thermisch (verwarmen), pH wijzigingen, destabillisatie (ureum of formamide)
- Tm waarde/smelttemperatuur: temp waarbij de helft van de basen ongepaard is. Neemt toe
bij meer GC baseparen. 3 H bruggen ipv 2 bij een AT bp.
- Renaturatie: bij een temp die 25°C lager ligt dan de Tm.
UV spectrofotometrie:
gebruikt bij de meting of detectie van
denaturatie.
DS DNA bij 260nm: lagere absorbantie
SS DNA bij 260nm: hogere absorbantie
bepaling van de zuiverheid van DNA
OD 260
- Zuiver DNA = =1,8
OD 280
- Zie extra document in geval van
onzuiverheden.
schatting van de hoeveelheid DNA
Renaturatie:
Homologe renaturatie Heterologe renaturatie
Volledig complementair stuk identiek DNA, Geen volledige complementariteit, er ontstaan
renaturatie tot exact dezelfde DS als ervoor. mismatches.
Kationen lagere afstoting (neg dna) Tm is 1,4°C lager per mismatch.
hogere Tm
2
, 3. DNA-replicatie
Eigenschappen:
- 50 basen per seconde
- DNA-polymerase
- Deoxyribonucleotide trifosfaten
- Semi-conservatief
- Assymetrische replicatievork leading en
lagging strand
- Bestaande DNA-streng als template
Origin of replication: DNA-sequentie van ongeveer 300 basen lang (AT-rijk), hier ontstaan 2
replicatievorken. (links en rechts)
ontstaan van de replicatievork: (katalytische reacties)
DNA helicase bindt op initiator proteïnen die op de origin of replication binden.
Single-strand DNA-binding proteins (SSB): eiwitten die de gevormde enkelstrengen stabiel houden.
Ringvormig eiwit helpt DNA-polymerase op de streng te binden.
DNA-polymerase
- Proof-reading activiteit: fouten herstellen of voorkomen tijdens het overschrijven. = 5’-3’ – 5’
exonuclease-activiteit
- Lagging strand: okazaki fragmenten
- Synthese wWerking: 5’-3’-richting
- Primers!
DNA-primase: eiwit die zorgt voor de aanmaak van RNAprimers van 10 basen.
DNA-primase: 5’-3’ richting
3’-OH uiteinde primers GEEN mismatch!
De additionele 5’-3’ exonuclease activiteit zal RNA stukje van het vooliggend okazaki
fragment verwijderen. (zie slide)
DNA-ligase: zorgt voor de uiteindelijke verbinding van de okazakifragmenten.
Primosoom: multiproteïnecomplex verantwoordelijk voor de start van de replicatie. Helicase +
Primase.
II.2 de polymerase chain reacti on of PCR
1. Principe van de PCR reactie
Analyse van genen = naald in een hooiberg, veel naalden maken maakt het gemakkelijker om er te
vinden, dus enorme hoeveelheid kopieën gemaakt van deze naalden of genen = PCR.
PCR
- Template = enkelstrengig DNA
- DNA replicatie
- Denaturatie verhitten tot 94°C
- 2 primers nodig (werking polymerase); Primers wijzen met 3’ uiteinde naar elkaar
- 5’-3’ richting
- Annealing primers = renaturatie
3
