Toolbox biotechnologie: Hoofdstuk 2
Gelelektroforese
Horizontale elektroforese
DNA scheiding
Gel = agarose
Nancy, Redsafe (vroeger ethidiumbromide) of Diamond bindt specifiek aan DNA voor visualisatie
Verticale elektroforese
Eiwitscheiding
Gel = polyacrylamide
Coomassie blauw bindt aspecifiek aan EW
Stappenplan: methode en principe
Aanmaak buffer
Aanmaak agarose gel
Laden gel
Elektroforese
DNA visualisatie
Aanmaak buffer
TBE of TAE = heeft 2-voudige beschermende functie
Bestaat uit:
Tris (base)
Zorgt ervoor dat pH behouden blijft en beschermd DNA tegen hydrolyse
Boorzuur of Acetaat (zuur)
EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) → blokkeert werking van DNase
Deze buffer word gebruikt voor de aanmaak van de agarose gel
Aanmaak agarose
Agarose = extract van zeewier
moleculaire zeef = kleinere molecule DNA zullen sneller doorheen gel bewegen dan grotere
1g agar (poeder) per 100 ml TBE (buffer) = 1% gel
Agarosepercentages kunnen variëren van 0.3% agarose tot 4%
Hoe kleiner het agarosepercentage hoe groter de te scheiden DNA grootte
Poeder + buffer mengen en opwarmen tot kookpunt, daarna fluorescente dye toevoegen (Nancy)
Handwarme oplossing uitgieten in mal + slotkam toevoegen die na uitharden verwijdert word
Laden gel
Gel overbrengen in elektroforese toestel en aanvullen met TBE buffer tot gel volledig onder staat
DNA stalen pipetteren in de slotjes = laden van de gel
Laadbuffer/ loading dye word toegevoegd aan het DNA voor 2 redenen:
Bevat kleurstof: om pipetteerproces en elektroforese makkelijker visueel te volgen
bevat glycerol: maakt DNA oplossing zwaarder zodat deze makkelijk uitzakt in de slotjes
(densiteit van DNA oplossing wordt verhoogd)
Elektroforese
40 tot 60 minuten op 70 – 100V
Elektrisch veld ontstaat: - geladen DNA moleculen kunnen migreren richting positieve electrode
DNA is negatief geladen en migreert van de kathode (-) naar de anode (+)
Elektrocutiegevaar
De afstand van migratie gebeurt in functie van de grootte van de moleculen
Steeds visueel volgen
Controle of elektroforese gestart is = vorming van bellen
Gelelektroforese
Horizontale elektroforese
DNA scheiding
Gel = agarose
Nancy, Redsafe (vroeger ethidiumbromide) of Diamond bindt specifiek aan DNA voor visualisatie
Verticale elektroforese
Eiwitscheiding
Gel = polyacrylamide
Coomassie blauw bindt aspecifiek aan EW
Stappenplan: methode en principe
Aanmaak buffer
Aanmaak agarose gel
Laden gel
Elektroforese
DNA visualisatie
Aanmaak buffer
TBE of TAE = heeft 2-voudige beschermende functie
Bestaat uit:
Tris (base)
Zorgt ervoor dat pH behouden blijft en beschermd DNA tegen hydrolyse
Boorzuur of Acetaat (zuur)
EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) → blokkeert werking van DNase
Deze buffer word gebruikt voor de aanmaak van de agarose gel
Aanmaak agarose
Agarose = extract van zeewier
moleculaire zeef = kleinere molecule DNA zullen sneller doorheen gel bewegen dan grotere
1g agar (poeder) per 100 ml TBE (buffer) = 1% gel
Agarosepercentages kunnen variëren van 0.3% agarose tot 4%
Hoe kleiner het agarosepercentage hoe groter de te scheiden DNA grootte
Poeder + buffer mengen en opwarmen tot kookpunt, daarna fluorescente dye toevoegen (Nancy)
Handwarme oplossing uitgieten in mal + slotkam toevoegen die na uitharden verwijdert word
Laden gel
Gel overbrengen in elektroforese toestel en aanvullen met TBE buffer tot gel volledig onder staat
DNA stalen pipetteren in de slotjes = laden van de gel
Laadbuffer/ loading dye word toegevoegd aan het DNA voor 2 redenen:
Bevat kleurstof: om pipetteerproces en elektroforese makkelijker visueel te volgen
bevat glycerol: maakt DNA oplossing zwaarder zodat deze makkelijk uitzakt in de slotjes
(densiteit van DNA oplossing wordt verhoogd)
Elektroforese
40 tot 60 minuten op 70 – 100V
Elektrisch veld ontstaat: - geladen DNA moleculen kunnen migreren richting positieve electrode
DNA is negatief geladen en migreert van de kathode (-) naar de anode (+)
Elektrocutiegevaar
De afstand van migratie gebeurt in functie van de grootte van de moleculen
Steeds visueel volgen
Controle of elektroforese gestart is = vorming van bellen
