Ruwe scheidingstechnieken 1: centrifugatie
Theoretische
beschrijving
van
de
sedimentatie
Bij
centrifugatie
wordt
een
kracht
Fsedimentatie
uitgeoefend
op
een
massa
m,
die
zich
op
een
afstand
r
bevindt
tot
het
punt,
waarrond
het
draait
met
een
hoeksnelheid
ω
(rad/sec).
à
Fsedimentatie
bestaat
uit
twee
componenten:
§ De
centrifugale
kracht
op
het
partikel:
mω²r
→
POSITIEF
§ De
kracht
van
Archimedes
(flotatiekracht)
uitgevoerd
door
het
solvent:
VPρω²r
→
NEGATIEF
𝐹!"#"$"%&'&(" = 𝑚𝜔²𝑟 − 𝑉! 𝜌𝜔²𝑟
Met
VP
=
volume
van
het
partikel
en
ρ
=
de
densiteit
van
het
solvent
Bij
beweging
van
het
partikel
door
het
solvent
is
het
onderhevig
aan
de
wrijvingskracht,
bepaald
door
de
sedimentatiesnelheid
(v)
en
de
frictiecoëfficiënt
(f).
𝐹!"#$%#& = 𝑣𝑓
Het
partikel
zal
dus
versnellen
tot
Fsedimentatie
=
Ffrictie:
𝐹!"#"$"%&'&(" = 𝐹!"#$%#& ↔ 𝑚𝜔²𝑟 − 𝑉! 𝜌𝜔²𝑟 = 𝑣𝑓
De
massa
van
1mol
partikels,
M,
is
gelijk
aan
mN
(met
N=
6,022
x
1023)
Oplossen
van
een
partikel
met
massa
m,
brengt
een
volumeverandering
VP
teweeg.
Het
partiële
specifieke
volume
𝑉
is
de
volumeverandering
bij
toevoegen
van
1g
stof
(drooggewicht)
in
een
oneindig
volume
solvent.
𝑉! ∆𝑉 𝑉𝑀
= = 𝑉 ↔ 𝑉! = 𝑉𝑚 =
𝑚 1𝑔 𝑁
§ Voor
de
meeste
eiwitten
is
het
partiële
specifieke
volume
in
water
(20°C)
ongeveer
0,73cm3/g
§ Voor
DNA:
0,5cm3/g
Door
substitutie
in
de
centrifugatie
vergelijking,
krijgt
men
dan:
𝑣𝑓 = 𝑚𝜔²𝑟 − 𝑉! 𝜌𝜔²𝑟
𝑀𝜔²𝑟 𝑉𝑀𝜌𝜔²𝑟
𝑣𝑓 = −
𝑁 𝑁
𝑀(1 − 𝑉𝜌)𝜔²𝑟
𝑣𝑓 =
𝑁
De
sedimentatiecoëfficiënt
De
sedimentatiecoëfficiënt
s
is
de
verhouding
tussen
de
lineaire
snelheid
van
het
partikel
en
de
rotatiesnelheid:
𝑣 𝑀(1 − 𝑉𝜌)
𝑠= =
𝜔²𝑟 𝑁𝑓
uitgedrukt
in
Svedbergs
eenheden
(S)
=
10-‐13s.
7
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
Ruwe
scheidingstechnieken
1:
centrifugatie
,
Uit
deze
vergelijking
kan
afgeleid
worden
dat
de
massa
van
een
partikel
berekend
kan
worden
uit
de
sedimentatiecoëfficiënt
en
de
dichtheid
van
de
oplossing,
indien
de
frictiecoëfficiënt
en
de
dichtheid
gekend
zijn.
§ Vroeger:
massabepaling
van
macromoleculen
a.d.h.v.
analytische
ultracentrifugatie.
à
optische
bepaling
van
de
sedimentatie
snelheid
à
de
frictiecoëfficiënt
kan
geëlimineerd
worden
door
metingen
van
de
diffusiecoëfficiënt
(D)
te
gebruiken.
à
dit
a.d.h.v.
‘dynamic
light
scattering’
experimenten:
Meten
van
de
lichtverstooiing
in
een
zeer
klein
volume,
waardoor
het
aantal
macromoleculen
die
aanwezig
zijn
in
het
volume
fluctueert
met
de
tijd
als
gevolg
van
diffusie.
→
D
berekenen
uit
intensiteitfluctuaties.
𝑀(1 − 𝑉𝜌)
R
=
de
gasconstante
𝑠=
T
=
de
absolute
temperatuur
𝑁𝑓 𝑠𝑅𝑇
𝑀=
D
=
de
diffusiecoëfficiënt
𝑅𝑇 𝐷(1 − 𝑉𝜌)
𝐷=
ρ
=
dichtheid
van
het
solvent
𝑁𝑓 𝑉
=
het
partieel
specifiek
volume
à
om
deze
waarden
met
elkaar
te
vergelijken,
worden
ze
genormaliseerd
naar
water
en
20°C
à
tegenwoordig
zijn
deze
technieken
grotendeels
vervangen
door
gel
filtratiechromatografie,
SDS-‐polyacrylamide
gelelectroforese
en
massaspectrometrie.
Uitdrukken
van
centrifugale
kracht
in
RCF
De
relatieve
centrifugale
kracht
elimineert
de
massa
uit
de
vergelijking,
zodat
er
een
meer
algemene
vergelijking
bekomen
wordt,
die
onafhankelijk
is
van
het
partikel:
𝐹!"#$%&'()*$&" 𝑚𝜔²𝑟
𝑅𝐶𝐹 = = = 𝜔²𝑟𝑔!!
𝐹!"#$%&#&%' 𝑚𝑔
Merk
op:
bij
constante
rotatiesnelheid
is
de
RCF
afhankelijk
van
de
afstand
r.
à
daarom
wordt
bij
de
beschrijving
van
een
rotor
de
maximale
ω
en
maximale
RCF
gegeven.
§ Hoeksnelheid
(ω)
kan
uitgedrukt
worden
in
rad/s
(rps)
of
in
rounds/min
(rpm).
§ Omrekening
gebeurt
als
volgt:
!!
𝜔 = 𝑥 𝑟𝑝𝑠 = 𝑦 𝑥 = 𝑦 (𝑟𝑝𝑚)
!"
!
§ 𝑅𝐶𝐹 =
r
x²
!"#
§ Of
𝑅𝐶𝐹 = 1,12 𝑥 10!! 𝑟 𝑦²
Verschillende
centrifugatiemethoden
De
verschillende
vormen
van
centrifugatie
§ Sedimentatie
experimenten:
à
grenssedimentatie
of
differentiële
centrifugatie
(m.i.v.
analytische
ultracentrifugatie)
à
zonesedimentatie
of
dichtheidsgradiëntcentrifugatie
in
voorgevormde
gradiënten.
(overal
in
de
gradiënt
is
de
dichtheid
van
de
deeltjes
(ρd)
groter
dan
die
van
de
oplossing
(ρo).
§ Evenwichtsdichtheidcentrifugatie:
à
isopycnische
of
evenwichtsdichtheidcentrifugatie
gebasseerd
op
een
transportevenwicht
dat
bepaald
wordt
door
diffusie
en
sedementatie.
(op
een
bepaalde
plaats:
ρd
=
ρo)
8
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
Ruwe
scheidingstechnieken
1:
centrifugatie
,
Grenssedimentatie
(differentiële
centrifugatie)
§ Principe:
centrifugatie
met
een
‘fixed-‐angle’
of
‘swinging
bucket’
centrifuge
waarbij
de
deeltjes
sedimenteren
tot
op
de
bodem
van
een
homogeen
gevulde
centrifugeerbuis.
§ De
tijd
t1
die
moleculen
met
een
sedimentatiecoëficiënt
s
nodig
hebben
om
zich
bij
een
gegeven
toerental
op
de
bodem
van
de
buis
verzamelen
is:
1 𝑑𝑟 1 𝑑𝑟
𝑠 = ↔ 𝑠𝑑𝑡 =
𝜔²𝑟 𝑑𝑡 𝜔² 𝑟
!! ! !!"# !" !
Na
integratie:
𝑠 𝑑𝑡 = ↔ 𝑠𝑡! = (ln 𝑟!"# − ln 𝑟!"# )
! !² !!"# ! !!
!
!" !"#
!!"# !
𝑡! = =
als
ω
in
rps
!"² !
!,!" ! !"!!! !"(!!"# !!"# )
(!"!)² !
𝑡! = =
als
ω
in
rpm
! !
à
k
is
de
clearance
factor.
Deze
is
constant
en
enkel
afhankelijk
van
de
geometrie
van
de
rotor
en
het
toerental.
K
~
de
efficiëntie
van
het
pelleteren
van
de
rotor.
HOE
KLEINER,
HOE
EFFICIËNTER!
Toepassing:
fractionatie
van
een
homogenaat
door
differentiële
centrifugatie:
§ Afzonderen
van
verschillende
componenten
door
aanpassingen
in
centrifugatietijd
en
–snelheid.
§ Gebruik
van
karakteristieke
enzymatische
activiteiten
voor
identificatie
en
bepaling
van
de
zuiverheid
van
een
fractie.
Zonesedimentatie
(dichtheidsgradiëntcentrifugatie)
§ Nadeel
van
differentiële
centrifugatie
=
zeer
lage
resolutie
à
enkel
het
traagste
component
wordt
volledig
gescheiden
van
de
andere
componenten.
à
zonesedimentatie:
heeft
dit
probleem
niet!
§ Principe:
centrifugatie
met
een
‘swinging
bucket’
rotor
in
een
dichtheidsgradiënt.
à
de
deeltjes
sedimenteren
en
vormen
discrete
banden
of
zone’s
à
centrifugatie
wordt
gestopt
voor
alle
banden
samenkomen
in
het
pellet,
zodat
de
verschillende
zone’s
gecollecteerd
kunnen
worden.
§ Soorten
dichtheidsgradiënten:
à
stappen
gradiënt:
wordt
bekomen
door
verschillende
vloeistoflagen
met
dalende
dichtheid
bovenop
elkaar
te
pipetteren.
à
lineaire
gradiënt:
wordt
bekomen
a.d.h.v.
communicerende
vaten
(begin-‐
en
einddichtheid).
§ Zonevorming:
Naarmate
de
partikels
doorheen
de
gradiënt
bewegen,
neemt
de
wrijvings-‐
en
flotatiekracht
toe.
Er
moet
meer
solvent
verplaatst
worden
voor
hetzelfde
volume.
→
samengedrukt
tot
banden.
à
in
de
gradiënt
is
de
afgelegde
weg
evenredig
met
de
sedimentatiecoëfficiënt
(s).
à
per
experiment
moet
er
een
refentiecomponent
aanwezig
zijn
met
gekende
s.
§ Specificaties
van
een
ideaal
gradiëntmedium:
à
goed
oplosbaar,
stabiel
in
oplossing
→
om
oplossingen
met
voldoende
hoge
dichtheid
te
bekomen.
à
minimale
verandering
van
de
viscositeit
à
inert
en
geen
absorptie
van
licht
bij
de
gebruikte
analytische
golflengte
9
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
Ruwe
scheidingstechnieken
1:
centrifugatie
Theoretische
beschrijving
van
de
sedimentatie
Bij
centrifugatie
wordt
een
kracht
Fsedimentatie
uitgeoefend
op
een
massa
m,
die
zich
op
een
afstand
r
bevindt
tot
het
punt,
waarrond
het
draait
met
een
hoeksnelheid
ω
(rad/sec).
à
Fsedimentatie
bestaat
uit
twee
componenten:
§ De
centrifugale
kracht
op
het
partikel:
mω²r
→
POSITIEF
§ De
kracht
van
Archimedes
(flotatiekracht)
uitgevoerd
door
het
solvent:
VPρω²r
→
NEGATIEF
𝐹!"#"$"%&'&(" = 𝑚𝜔²𝑟 − 𝑉! 𝜌𝜔²𝑟
Met
VP
=
volume
van
het
partikel
en
ρ
=
de
densiteit
van
het
solvent
Bij
beweging
van
het
partikel
door
het
solvent
is
het
onderhevig
aan
de
wrijvingskracht,
bepaald
door
de
sedimentatiesnelheid
(v)
en
de
frictiecoëfficiënt
(f).
𝐹!"#$%#& = 𝑣𝑓
Het
partikel
zal
dus
versnellen
tot
Fsedimentatie
=
Ffrictie:
𝐹!"#"$"%&'&(" = 𝐹!"#$%#& ↔ 𝑚𝜔²𝑟 − 𝑉! 𝜌𝜔²𝑟 = 𝑣𝑓
De
massa
van
1mol
partikels,
M,
is
gelijk
aan
mN
(met
N=
6,022
x
1023)
Oplossen
van
een
partikel
met
massa
m,
brengt
een
volumeverandering
VP
teweeg.
Het
partiële
specifieke
volume
𝑉
is
de
volumeverandering
bij
toevoegen
van
1g
stof
(drooggewicht)
in
een
oneindig
volume
solvent.
𝑉! ∆𝑉 𝑉𝑀
= = 𝑉 ↔ 𝑉! = 𝑉𝑚 =
𝑚 1𝑔 𝑁
§ Voor
de
meeste
eiwitten
is
het
partiële
specifieke
volume
in
water
(20°C)
ongeveer
0,73cm3/g
§ Voor
DNA:
0,5cm3/g
Door
substitutie
in
de
centrifugatie
vergelijking,
krijgt
men
dan:
𝑣𝑓 = 𝑚𝜔²𝑟 − 𝑉! 𝜌𝜔²𝑟
𝑀𝜔²𝑟 𝑉𝑀𝜌𝜔²𝑟
𝑣𝑓 = −
𝑁 𝑁
𝑀(1 − 𝑉𝜌)𝜔²𝑟
𝑣𝑓 =
𝑁
De
sedimentatiecoëfficiënt
De
sedimentatiecoëfficiënt
s
is
de
verhouding
tussen
de
lineaire
snelheid
van
het
partikel
en
de
rotatiesnelheid:
𝑣 𝑀(1 − 𝑉𝜌)
𝑠= =
𝜔²𝑟 𝑁𝑓
uitgedrukt
in
Svedbergs
eenheden
(S)
=
10-‐13s.
7
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
Ruwe
scheidingstechnieken
1:
centrifugatie
,
Uit
deze
vergelijking
kan
afgeleid
worden
dat
de
massa
van
een
partikel
berekend
kan
worden
uit
de
sedimentatiecoëfficiënt
en
de
dichtheid
van
de
oplossing,
indien
de
frictiecoëfficiënt
en
de
dichtheid
gekend
zijn.
§ Vroeger:
massabepaling
van
macromoleculen
a.d.h.v.
analytische
ultracentrifugatie.
à
optische
bepaling
van
de
sedimentatie
snelheid
à
de
frictiecoëfficiënt
kan
geëlimineerd
worden
door
metingen
van
de
diffusiecoëfficiënt
(D)
te
gebruiken.
à
dit
a.d.h.v.
‘dynamic
light
scattering’
experimenten:
Meten
van
de
lichtverstooiing
in
een
zeer
klein
volume,
waardoor
het
aantal
macromoleculen
die
aanwezig
zijn
in
het
volume
fluctueert
met
de
tijd
als
gevolg
van
diffusie.
→
D
berekenen
uit
intensiteitfluctuaties.
𝑀(1 − 𝑉𝜌)
R
=
de
gasconstante
𝑠=
T
=
de
absolute
temperatuur
𝑁𝑓 𝑠𝑅𝑇
𝑀=
D
=
de
diffusiecoëfficiënt
𝑅𝑇 𝐷(1 − 𝑉𝜌)
𝐷=
ρ
=
dichtheid
van
het
solvent
𝑁𝑓 𝑉
=
het
partieel
specifiek
volume
à
om
deze
waarden
met
elkaar
te
vergelijken,
worden
ze
genormaliseerd
naar
water
en
20°C
à
tegenwoordig
zijn
deze
technieken
grotendeels
vervangen
door
gel
filtratiechromatografie,
SDS-‐polyacrylamide
gelelectroforese
en
massaspectrometrie.
Uitdrukken
van
centrifugale
kracht
in
RCF
De
relatieve
centrifugale
kracht
elimineert
de
massa
uit
de
vergelijking,
zodat
er
een
meer
algemene
vergelijking
bekomen
wordt,
die
onafhankelijk
is
van
het
partikel:
𝐹!"#$%&'()*$&" 𝑚𝜔²𝑟
𝑅𝐶𝐹 = = = 𝜔²𝑟𝑔!!
𝐹!"#$%&#&%' 𝑚𝑔
Merk
op:
bij
constante
rotatiesnelheid
is
de
RCF
afhankelijk
van
de
afstand
r.
à
daarom
wordt
bij
de
beschrijving
van
een
rotor
de
maximale
ω
en
maximale
RCF
gegeven.
§ Hoeksnelheid
(ω)
kan
uitgedrukt
worden
in
rad/s
(rps)
of
in
rounds/min
(rpm).
§ Omrekening
gebeurt
als
volgt:
!!
𝜔 = 𝑥 𝑟𝑝𝑠 = 𝑦 𝑥 = 𝑦 (𝑟𝑝𝑚)
!"
!
§ 𝑅𝐶𝐹 =
r
x²
!"#
§ Of
𝑅𝐶𝐹 = 1,12 𝑥 10!! 𝑟 𝑦²
Verschillende
centrifugatiemethoden
De
verschillende
vormen
van
centrifugatie
§ Sedimentatie
experimenten:
à
grenssedimentatie
of
differentiële
centrifugatie
(m.i.v.
analytische
ultracentrifugatie)
à
zonesedimentatie
of
dichtheidsgradiëntcentrifugatie
in
voorgevormde
gradiënten.
(overal
in
de
gradiënt
is
de
dichtheid
van
de
deeltjes
(ρd)
groter
dan
die
van
de
oplossing
(ρo).
§ Evenwichtsdichtheidcentrifugatie:
à
isopycnische
of
evenwichtsdichtheidcentrifugatie
gebasseerd
op
een
transportevenwicht
dat
bepaald
wordt
door
diffusie
en
sedementatie.
(op
een
bepaalde
plaats:
ρd
=
ρo)
8
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
Ruwe
scheidingstechnieken
1:
centrifugatie
,
Grenssedimentatie
(differentiële
centrifugatie)
§ Principe:
centrifugatie
met
een
‘fixed-‐angle’
of
‘swinging
bucket’
centrifuge
waarbij
de
deeltjes
sedimenteren
tot
op
de
bodem
van
een
homogeen
gevulde
centrifugeerbuis.
§ De
tijd
t1
die
moleculen
met
een
sedimentatiecoëficiënt
s
nodig
hebben
om
zich
bij
een
gegeven
toerental
op
de
bodem
van
de
buis
verzamelen
is:
1 𝑑𝑟 1 𝑑𝑟
𝑠 = ↔ 𝑠𝑑𝑡 =
𝜔²𝑟 𝑑𝑡 𝜔² 𝑟
!! ! !!"# !" !
Na
integratie:
𝑠 𝑑𝑡 = ↔ 𝑠𝑡! = (ln 𝑟!"# − ln 𝑟!"# )
! !² !!"# ! !!
!
!" !"#
!!"# !
𝑡! = =
als
ω
in
rps
!"² !
!,!" ! !"!!! !"(!!"# !!"# )
(!"!)² !
𝑡! = =
als
ω
in
rpm
! !
à
k
is
de
clearance
factor.
Deze
is
constant
en
enkel
afhankelijk
van
de
geometrie
van
de
rotor
en
het
toerental.
K
~
de
efficiëntie
van
het
pelleteren
van
de
rotor.
HOE
KLEINER,
HOE
EFFICIËNTER!
Toepassing:
fractionatie
van
een
homogenaat
door
differentiële
centrifugatie:
§ Afzonderen
van
verschillende
componenten
door
aanpassingen
in
centrifugatietijd
en
–snelheid.
§ Gebruik
van
karakteristieke
enzymatische
activiteiten
voor
identificatie
en
bepaling
van
de
zuiverheid
van
een
fractie.
Zonesedimentatie
(dichtheidsgradiëntcentrifugatie)
§ Nadeel
van
differentiële
centrifugatie
=
zeer
lage
resolutie
à
enkel
het
traagste
component
wordt
volledig
gescheiden
van
de
andere
componenten.
à
zonesedimentatie:
heeft
dit
probleem
niet!
§ Principe:
centrifugatie
met
een
‘swinging
bucket’
rotor
in
een
dichtheidsgradiënt.
à
de
deeltjes
sedimenteren
en
vormen
discrete
banden
of
zone’s
à
centrifugatie
wordt
gestopt
voor
alle
banden
samenkomen
in
het
pellet,
zodat
de
verschillende
zone’s
gecollecteerd
kunnen
worden.
§ Soorten
dichtheidsgradiënten:
à
stappen
gradiënt:
wordt
bekomen
door
verschillende
vloeistoflagen
met
dalende
dichtheid
bovenop
elkaar
te
pipetteren.
à
lineaire
gradiënt:
wordt
bekomen
a.d.h.v.
communicerende
vaten
(begin-‐
en
einddichtheid).
§ Zonevorming:
Naarmate
de
partikels
doorheen
de
gradiënt
bewegen,
neemt
de
wrijvings-‐
en
flotatiekracht
toe.
Er
moet
meer
solvent
verplaatst
worden
voor
hetzelfde
volume.
→
samengedrukt
tot
banden.
à
in
de
gradiënt
is
de
afgelegde
weg
evenredig
met
de
sedimentatiecoëfficiënt
(s).
à
per
experiment
moet
er
een
refentiecomponent
aanwezig
zijn
met
gekende
s.
§ Specificaties
van
een
ideaal
gradiëntmedium:
à
goed
oplosbaar,
stabiel
in
oplossing
→
om
oplossingen
met
voldoende
hoge
dichtheid
te
bekomen.
à
minimale
verandering
van
de
viscositeit
à
inert
en
geen
absorptie
van
licht
bij
de
gebruikte
analytische
golflengte
9
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
Ruwe
scheidingstechnieken
1:
centrifugatie
