Biochemie vragen
Hoofdstuk 3: Aminozuren
HOOFDVRAGEN
• Chromatografie
niet alle chromatografieën maar bv 2 gevraagd en die uitleggen
Om eiwitten te scheiden en zuiveren moet eerst het weefsel gemixt
worden waardoor er allemaal aparte stukjes van structuren zijn. Deze
stukjes moeten gescheiden worden om uiteindelijk enkel eiwitten over te
houden. Deze scheiding gebeurt aan de hand van differentiële
centrifugatie. Hierbij ondergaat de oplossing centrifugatie aan steeds
hogere snelheden zodat de onderdelen met de hoogste densiteit zullen
neerslagen. Deze neerslag wordt dan verwijderd; dit is de zuivering. Na de
laatste centrifugatie, aan zeer hoge snelheid, zal er enkel nog een
eiwitmengsel overblijven, geen celorganellen meer.
De eiwit-oplossing kan worden gescheiden in verschillende fracties door
middel van chromatografie. Er zijn verschillende soorten
chromatografieën. Het verschil tussen de soorten chromatografieën zit in
hoe de moleculen van de mobiele fase interageren met de moleculen van
de stationaire fase.
1. Kolomchromatografie
Bij kolomchromatografie bestaat de vaste fase uit een poreuze matrix
waar de mobiele fase doorheen beweegt. De snelheid waarmee de
vloeistof zich doorheen de matrix beweegt is afhankelijk van de
eigenschappen van de vloeistof en van de matrix. Zetmeel kan
bijvoorbeeld gebruikt worden als vaste fase. Zetmeel is een polaire stof,
wat betekent dat de polaire delen van het eiwitmengsel (de eiwitten met
meer polaire aminozuren) trager doorheen de matrix zullen bewegen
dan de apolaire delen. Op die manier ontstaat er verschillende banden,
gescheiden van elkaar door middel van de polariteit. Naarmate de stof
langer doorheen de kolom loopt zullen de banden en de spatie ertussen
verbreden, waarna ze apart kunnen opgevangen worden onderaan de
kolom. Nu zijn er verschillende fracties aan eiwitmengsel gescheiden van
elkaar. Belangrijk om op te merken is dat er geen aparte eiwitten geïsoleerd zijn, maar slechts
fracties met gelijkaardige polariteit.
2. Ionenuitwisselingschromatografie
Bij deze chromatografie interageren de geladen eiwitten met een matrix die
bestaat uit een synthetisch polymeer met geladen groepen. Dit kan een matrix
van anionen (kationen uitwisselingschromatografie) of van kationen (anionen
uitwisselingschromatografie) zijn. Als de matrix bijvoorbeeld bestaat uit
1
Biochemie 22/23
,negatief geladen deeltjes, zullen de meer positieve eiwitten van het mengsel (de eiwitten met meer
positief geladen aminozuren) trager doorheen de matrix bewegen dan de negatievere eiwitten. Zo
ontstaat er een bandenpatroon aan de hand van de lading van de eiwitten, en deze banden kunnen
weer een voor een opgevangen worden onderaan de kolom. De lading van eiwitten en dus ook de
scheiding is afhankelijk van de pH van de oplossing.
3. Size-exclusion chromatography (moleculaire-zeef chromatografie)
In deze vorm van chromatografie worden eiwitfracties gescheiden op basis
van hun grootte. De matrix bestaat uit kralen van polymeren met kanaaltjes
in waar de moleculen doorheen bewegen. Kleine eiwitfracties kunnen
makkelijker in die kanaaltjes waardoor het langer duurt om doorheen de
kolom te bewegen omdat ze telkens in en uit de kanaaltjes moeten gaan.
Grotere moleculen bewegen vrijer doorheen de matrix waardoor ze sneller
zullen bewegen en er weer een bandenpatroon zal ontstaan.
4. Affiniteitschromatografie
Hierbij bestaat de matrix uit liganden die specifiek met
bepaalde eiwitten kunnen binden. Een veel gebruikte
toepassing van deze chromatografie is de immuno-
affiniteitschromatografie. Hierbij worden antilichamen
gebruikt als ligand: die kunnen zeer specifiek binden met één
bepaald eiwit (deze eiwitten hebben dus een hoge
affiniteit/aantrekkingskracht voor dit ligand). Dit eiwit zal
blijven hangen in de kolom terwijl de rest van het eiwitmengsel
er doorheen loopt. Hierna moeten de eiwitten dan weer
losgemaakt worden van het ligand. Dit kan door een mengsel
met hoge zoutconcentratie doorheen de kolom te laten lopen
waardoor de ionaire eiwit-ligand reacties verbroken worden of
door competitie met andere liganden waarmee het eiwit kan binden zodat het los komt van de
matrix en door de kolom kan lopen.
• Elektroforese
immunoblot uitleggen = typische vraag
Elektroforese is het scheiden van eiwitten in een elektrisch veld.
Omdat de eiwitten een netto lading hebben zullen ze bewegen
doorheen het veld naar de richting van de tegengestelde lading. De
2
Biochemie 22/23
,matrix is een cross linked polymeer, bv. polyacrylamide -> PAGE = polyacrylamide gel electroforese.
De matrix is een soort van zeef waar eiwitten worden gescheden naar hun massa en vorm. De
eiwitten worden behandeld met SDS, een detergentmolecule. Deze molecule heeft een polaire kop
en een apolaire staart. SDS zorgt ervoor dat eiwitten denatureren waardoor ze allemaal bolvormig
worden en het geeft een uniforme negatieve lading aan de reeds geladen eiwitten waardoor ze
aangetrokken worden door de positieve pool op basis van hun grootte en niet hun lading, die kan
verschillen. Grote eiwitten bewegen moeilijker doorheen de gel waardoor ze trager zijn dan kleinere
eiwitten, zo ontstaat een bandenpatroon en kunnen de eiwitten geïdentificeerd worden. Eiwitten
zijn kleurloos dus er wordt een kleurstof toegevoegd, bv. Coomassie blue die aan de eiwitten kan
binden zodat ze zichtbaar worden en geïdentificeerd kunnen worden.
Om de massa van het onbekende eiwit te
schatten wordt het vergeleken met merker
eiwitten. Dit zijn eiwitten waarvan de massa al
gekend is, aan de hand hiervan kan gekeken
worden naar waar het onbekende eiwit zich
bevindt tov. de merker eiwitten en kan de
massa geschat worden. De massa van de
merkereiwitten wordt uitgezet in functie van
hoe ver het eiwit heeft bewogen in de gel. Dit is
de relative migration. Hierdoor krijg je een
rechte, en als de bewogen afstand van het
onbekende eiwit gekend is kan adhv. lineaire interpolatie vrij nauwkeurig de massa berekend
worden.
Een belangrijk deel van de elektroforese is de tracking dye, bv. broomfenol blauw. Deze kleurstof is
kleiner dan de eiwitten en gaat dus sneller (ongeveer even snel dan de kleinste eiwitten). Aan de
hand van de tracking dye kan dus ingeschat worden hoe ver de snelste eiwitten al gemigreerd zijn
zodat de elektroforese op tijd gestopt kan worden zodat de banden niet in elkaar overgaan.
Isoelectric focusing: Eerst worden de eiwitten onderworpen aan een pH gradiënt. Aan een met gel
gevuld buisje wordt een pH gradiënt aangebracht. De eiwitten worden daarna aan een opening
toegevoegd en er wordt een elektrisch veld over het buisje aangebracht. Net zoals bij PAGE gaan de
eiwitten migreren onder invloed van hun ladingen (AZ). Eens ze bij de pH = PI (iso-elektrisch punt)
aankomen, worden ze neutraal geladen en stoppen ze met bewegen. Nu zijn ze gescheiden op PI.
2D elektroforese: eerst PI dan PAGE. Aangezien de eiwitten na PI neutraal zijn => SDS toevoegen
voor lading.
3
Biochemie 22/23
, Een immunoblot / Western blot is een techniek
waarmee een specifiek eiwit in een mengsel van
eiwitten door middel van antilichamen
gedetecteerd kan worden. Blotting = eiwitten
overbrengen op nitrocellulose membraam.
In de eerste stap wordt het eiwitmengsel door
middel van gel-elektroforese in afzonderlijke
eiwitbanden gescheiden in een dragermatrix
(SDS-PAGE, Native-PAGE (natuurlijke
conformatie), isoelectric focusing, 2D-gel-
elektroforese), afhankelijk van de grootte van
het eiwit, de lading of andere eigenschappen.
De afgescheiden eiwitbanden worden vervolgens
overgebracht van de gel naar een vast
draagmembraan (nitrocellulose) voor de
Western blot. Dit proces wordt blotting
genoemd. Daar worden ze geblokkeerd met melk
(= blocking agent) om niet-specifieke
antilichaambinding te voorkomen, en vervolgens
gekleurd met antilichamen die specifiek zijn voor
het doeleiwit.
Het eiwit waarin men geïnteresseerd is kan gedetecteerd worden met een voor dat eiwit specifiek
antilichaam. Om dit specifiek gebonden antilichaam zichtbaar te maken wordt na incubatie met dit
eerste antilichaam de blot behandeld met een tweede antilichaam dat bindt aan het eerste
antilichaam. Dit tweede antilichaam is gelabeld zodat men precies kan zien waar het eerste
antilichaam gebonden heeft en dus waar het eiwit zich bevindt.
4
Biochemie 22/23
Hoofdstuk 3: Aminozuren
HOOFDVRAGEN
• Chromatografie
niet alle chromatografieën maar bv 2 gevraagd en die uitleggen
Om eiwitten te scheiden en zuiveren moet eerst het weefsel gemixt
worden waardoor er allemaal aparte stukjes van structuren zijn. Deze
stukjes moeten gescheiden worden om uiteindelijk enkel eiwitten over te
houden. Deze scheiding gebeurt aan de hand van differentiële
centrifugatie. Hierbij ondergaat de oplossing centrifugatie aan steeds
hogere snelheden zodat de onderdelen met de hoogste densiteit zullen
neerslagen. Deze neerslag wordt dan verwijderd; dit is de zuivering. Na de
laatste centrifugatie, aan zeer hoge snelheid, zal er enkel nog een
eiwitmengsel overblijven, geen celorganellen meer.
De eiwit-oplossing kan worden gescheiden in verschillende fracties door
middel van chromatografie. Er zijn verschillende soorten
chromatografieën. Het verschil tussen de soorten chromatografieën zit in
hoe de moleculen van de mobiele fase interageren met de moleculen van
de stationaire fase.
1. Kolomchromatografie
Bij kolomchromatografie bestaat de vaste fase uit een poreuze matrix
waar de mobiele fase doorheen beweegt. De snelheid waarmee de
vloeistof zich doorheen de matrix beweegt is afhankelijk van de
eigenschappen van de vloeistof en van de matrix. Zetmeel kan
bijvoorbeeld gebruikt worden als vaste fase. Zetmeel is een polaire stof,
wat betekent dat de polaire delen van het eiwitmengsel (de eiwitten met
meer polaire aminozuren) trager doorheen de matrix zullen bewegen
dan de apolaire delen. Op die manier ontstaat er verschillende banden,
gescheiden van elkaar door middel van de polariteit. Naarmate de stof
langer doorheen de kolom loopt zullen de banden en de spatie ertussen
verbreden, waarna ze apart kunnen opgevangen worden onderaan de
kolom. Nu zijn er verschillende fracties aan eiwitmengsel gescheiden van
elkaar. Belangrijk om op te merken is dat er geen aparte eiwitten geïsoleerd zijn, maar slechts
fracties met gelijkaardige polariteit.
2. Ionenuitwisselingschromatografie
Bij deze chromatografie interageren de geladen eiwitten met een matrix die
bestaat uit een synthetisch polymeer met geladen groepen. Dit kan een matrix
van anionen (kationen uitwisselingschromatografie) of van kationen (anionen
uitwisselingschromatografie) zijn. Als de matrix bijvoorbeeld bestaat uit
1
Biochemie 22/23
,negatief geladen deeltjes, zullen de meer positieve eiwitten van het mengsel (de eiwitten met meer
positief geladen aminozuren) trager doorheen de matrix bewegen dan de negatievere eiwitten. Zo
ontstaat er een bandenpatroon aan de hand van de lading van de eiwitten, en deze banden kunnen
weer een voor een opgevangen worden onderaan de kolom. De lading van eiwitten en dus ook de
scheiding is afhankelijk van de pH van de oplossing.
3. Size-exclusion chromatography (moleculaire-zeef chromatografie)
In deze vorm van chromatografie worden eiwitfracties gescheiden op basis
van hun grootte. De matrix bestaat uit kralen van polymeren met kanaaltjes
in waar de moleculen doorheen bewegen. Kleine eiwitfracties kunnen
makkelijker in die kanaaltjes waardoor het langer duurt om doorheen de
kolom te bewegen omdat ze telkens in en uit de kanaaltjes moeten gaan.
Grotere moleculen bewegen vrijer doorheen de matrix waardoor ze sneller
zullen bewegen en er weer een bandenpatroon zal ontstaan.
4. Affiniteitschromatografie
Hierbij bestaat de matrix uit liganden die specifiek met
bepaalde eiwitten kunnen binden. Een veel gebruikte
toepassing van deze chromatografie is de immuno-
affiniteitschromatografie. Hierbij worden antilichamen
gebruikt als ligand: die kunnen zeer specifiek binden met één
bepaald eiwit (deze eiwitten hebben dus een hoge
affiniteit/aantrekkingskracht voor dit ligand). Dit eiwit zal
blijven hangen in de kolom terwijl de rest van het eiwitmengsel
er doorheen loopt. Hierna moeten de eiwitten dan weer
losgemaakt worden van het ligand. Dit kan door een mengsel
met hoge zoutconcentratie doorheen de kolom te laten lopen
waardoor de ionaire eiwit-ligand reacties verbroken worden of
door competitie met andere liganden waarmee het eiwit kan binden zodat het los komt van de
matrix en door de kolom kan lopen.
• Elektroforese
immunoblot uitleggen = typische vraag
Elektroforese is het scheiden van eiwitten in een elektrisch veld.
Omdat de eiwitten een netto lading hebben zullen ze bewegen
doorheen het veld naar de richting van de tegengestelde lading. De
2
Biochemie 22/23
,matrix is een cross linked polymeer, bv. polyacrylamide -> PAGE = polyacrylamide gel electroforese.
De matrix is een soort van zeef waar eiwitten worden gescheden naar hun massa en vorm. De
eiwitten worden behandeld met SDS, een detergentmolecule. Deze molecule heeft een polaire kop
en een apolaire staart. SDS zorgt ervoor dat eiwitten denatureren waardoor ze allemaal bolvormig
worden en het geeft een uniforme negatieve lading aan de reeds geladen eiwitten waardoor ze
aangetrokken worden door de positieve pool op basis van hun grootte en niet hun lading, die kan
verschillen. Grote eiwitten bewegen moeilijker doorheen de gel waardoor ze trager zijn dan kleinere
eiwitten, zo ontstaat een bandenpatroon en kunnen de eiwitten geïdentificeerd worden. Eiwitten
zijn kleurloos dus er wordt een kleurstof toegevoegd, bv. Coomassie blue die aan de eiwitten kan
binden zodat ze zichtbaar worden en geïdentificeerd kunnen worden.
Om de massa van het onbekende eiwit te
schatten wordt het vergeleken met merker
eiwitten. Dit zijn eiwitten waarvan de massa al
gekend is, aan de hand hiervan kan gekeken
worden naar waar het onbekende eiwit zich
bevindt tov. de merker eiwitten en kan de
massa geschat worden. De massa van de
merkereiwitten wordt uitgezet in functie van
hoe ver het eiwit heeft bewogen in de gel. Dit is
de relative migration. Hierdoor krijg je een
rechte, en als de bewogen afstand van het
onbekende eiwit gekend is kan adhv. lineaire interpolatie vrij nauwkeurig de massa berekend
worden.
Een belangrijk deel van de elektroforese is de tracking dye, bv. broomfenol blauw. Deze kleurstof is
kleiner dan de eiwitten en gaat dus sneller (ongeveer even snel dan de kleinste eiwitten). Aan de
hand van de tracking dye kan dus ingeschat worden hoe ver de snelste eiwitten al gemigreerd zijn
zodat de elektroforese op tijd gestopt kan worden zodat de banden niet in elkaar overgaan.
Isoelectric focusing: Eerst worden de eiwitten onderworpen aan een pH gradiënt. Aan een met gel
gevuld buisje wordt een pH gradiënt aangebracht. De eiwitten worden daarna aan een opening
toegevoegd en er wordt een elektrisch veld over het buisje aangebracht. Net zoals bij PAGE gaan de
eiwitten migreren onder invloed van hun ladingen (AZ). Eens ze bij de pH = PI (iso-elektrisch punt)
aankomen, worden ze neutraal geladen en stoppen ze met bewegen. Nu zijn ze gescheiden op PI.
2D elektroforese: eerst PI dan PAGE. Aangezien de eiwitten na PI neutraal zijn => SDS toevoegen
voor lading.
3
Biochemie 22/23
, Een immunoblot / Western blot is een techniek
waarmee een specifiek eiwit in een mengsel van
eiwitten door middel van antilichamen
gedetecteerd kan worden. Blotting = eiwitten
overbrengen op nitrocellulose membraam.
In de eerste stap wordt het eiwitmengsel door
middel van gel-elektroforese in afzonderlijke
eiwitbanden gescheiden in een dragermatrix
(SDS-PAGE, Native-PAGE (natuurlijke
conformatie), isoelectric focusing, 2D-gel-
elektroforese), afhankelijk van de grootte van
het eiwit, de lading of andere eigenschappen.
De afgescheiden eiwitbanden worden vervolgens
overgebracht van de gel naar een vast
draagmembraan (nitrocellulose) voor de
Western blot. Dit proces wordt blotting
genoemd. Daar worden ze geblokkeerd met melk
(= blocking agent) om niet-specifieke
antilichaambinding te voorkomen, en vervolgens
gekleurd met antilichamen die specifiek zijn voor
het doeleiwit.
Het eiwit waarin men geïnteresseerd is kan gedetecteerd worden met een voor dat eiwit specifiek
antilichaam. Om dit specifiek gebonden antilichaam zichtbaar te maken wordt na incubatie met dit
eerste antilichaam de blot behandeld met een tweede antilichaam dat bindt aan het eerste
antilichaam. Dit tweede antilichaam is gelabeld zodat men precies kan zien waar het eerste
antilichaam gebonden heeft en dus waar het eiwit zich bevindt.
4
Biochemie 22/23
