1ste Bach. BMW Histologie
Zeno De Paus
,Zeno De Paus Histologie 1ste Bach. BMW
Deel 1: Microscopische technieken
Welke functies moet een microscoop kunnen vervullen?
Een microscoop moet volgende 3 functies kunnen vervullen:
• Vergroting: De microscoop moet een vergroot beeld van het specimen produceren
• Resolutie: De microscoop moet de details in het beeld scheiden
• Contrast: De microscoop moet de details zichtbaar maken voor het menselijk oog, voor
een camera of voor andere waarnemingsapparaten
Tot hoever kan het oog, een licht- en elektronenmicroscoop inzoomen? Wat is de resolutie?
Waarnemingsapparaat Vergroting Te onderscheiden afstand
Blote oog 1x 100-200µm (0,1-0,2mm)
Lichtmicroscoop 1000x 0,2µm
Elektronenmicroscoop 450 000x 0,1nm
De samengestelde lichtmicroscoop
Wat zijn enkelvoudige microscopen? Wat zijn samengestelde microscopen?
• Enkelvoudige microscopen: Dit zijn microscopen met één lens
• Samengestelde microscopen: Dit zijn microscopen met meerdere lenzen
Wat is het basisprincipe van een samengestelde microscoop?
Het basisprincipe van een samengestelde microscoop is: Het beeld dat door de eerste lens wordt
gevormd, wordt vergroot door de tweede lens, waardoor de vergroting die verkregen wordt, heel
wat hoger is dan bij een enkele lens
De onderdelen van de lichtmicroscoop
Welke delen heeft een lichtmicroscoop? Wat zijn is hun functie?
1. Het oculair: De lens waardoor je door de microscoop kijkt
2. De tubus: Verbindt het oculair met de objectieven
3. De objectieven in de revolver: Verschillende lenzen zitten op
de revolver, je kan veranderen door hieraan te draaien
4. De objecttafel: Plaats waar je het preparaat op legt
5. De kruistafel met nonius: Een verstelbare tafel waarmee je het
preparaat horizontaal en verticaal kunt bewegen
6. De condensor: Focust het licht op het preparaat
7. Het condensor diafragma: Regelt de hoeveelheid licht die de
condensor bereikt
8. De condensor schroef: Verandert de hoogte van de condensor
9. De macrometerschroef: Grote schroef om het preparaat snel
in focus te brengen
10. De micrometerschroef: Dient voor nauwkeurige scherpstelling
11. Het veld diafragma: Regelt hoeveelheid licht in gezichtsveld
12. De lamphouder met lamp: Bevat de lichtbron en zorgt voor verlichting
13. De lichtregeling: Regelt de intensiteit van het licht
14. De voet: Ondersteunt de microscoop en zorgt voor stabiliteit
Histologie 1
,Zeno De Paus Histologie 1ste Bach. BMW
Hoe lees je de informatie van een objectieflens af?
Op een objectieflens staan een aantal nummers gegraveerd, waaronder
de vergroting (… x) en de numerieke aperatuur (NA). De numerieke
aperatuur zegt iets over de globale resolutie van de lens, een hogere NA
wilt dus zeggen dat er een betere resolutie is
Voor het voorbeeld geldt:
• VERGROTING: 63x
• NA: 1,4
Hoe bekom je de vergroting van het uiteindelijke beeld van een microscoop?
Het uiteindelijke beeld bekom je door de vergroting van je objectief te vermenigvuldigen met de
vergroting van je oculair:
VERGR tot = VERGR obj . VERGR ocl
Resolutie en numerieke aperatuur
Wat is de belangrijkste overweging bij het kopen van een microscoop, waarom?
De belangrijkste overweging bij het kopen van een microscoop is de resolutie, dit is het
vermogen van een microscoop om twee punten op een coupe afzonderlijk te kunnen
waarnemen, voor de meeste lichtmicroscopen is deze afstand 0,2𝜇𝑚
Hoe bereken je de resolutie van een microscoop?
De formule van een resolutie van een microscoop is:
𝜆 Berekening van 𝜆
𝑅=
𝑁𝐴 𝑣 ℎ. 𝑐
𝜆= =
Hierbij is: 𝑓 𝐸
R → De resolutie Met:
λ → De golflengte van de belichting h = 6,626 . 10−34 J. s
NA → De numerieke apertuur van de objectieflens c = 3,00.108 m/s
Wat is de numerieke apertuur NA? Hoe bereken je deze
De numerieke apertuur NA is een kwaliteitswaardemeter voor het objectief en kan berekend
worden aan de hand van volgende formule:
𝑁𝐴 = 𝑛 . sin(𝜇)
Er geldt hier: Hoe hoger de numerieke apertuur NA, hoe beter de resolutie zal zijn
Hierbij is:
𝑛 → De brekingsindex van het medium
𝜇 → De halve tophoek van de apertuurkegel
Welke invloed heeft de belichtingsintensiteit om de resolutie?
Een lage belichtingsintensiteit heeft een lage resolutie tot gevolg → Hoge intensiteit is beter
Histologie 2
, Zeno De Paus Histologie 1ste Bach. BMW
Voorbereiding van een preparaat voor lichtmicroscopie
Waarom wordt een orgaan of weefsel eerst gefixeerd? Hoe gebeurt dit?
Het orgaan of weefsel dat, voor microscopisch onderzoek, uit een dier verwijderd wordt kan
gefixeerd worden door perfusie (door de bloedbaan) of door immersie (onderdompelen) in bv.
formaldehyde. Dit doen we om degradatie van het weefsel door bacteriën en enzymen (autolyse)
tegen te gaan
➔ Door fixatie blijft de (ultra)structuur van het weefsel bewaard
Hoe werkt een microtoom?
Een microtoom is een apparaat dat een met paraffine geïmpregneerd weefselblokje in een
houder vasthoudt en hier zeer dunne schijfjes van het weefselblokje afsnijdt
Hoe kunnen we een vloeistof onder de lichtmicroscoop bekijken?
Een vloeistof, zoals bloed of sperma, kan men onder de
lichtmicroscoop gebruiken door het preparaat d.m.v. uitstrijking
te prepareren. Bij uitstrijking zal men het dekglaasje tot aan de te
bekijken vloeistof brengen totdat de vloeistof aan dit dekglaasje
hangt. Nu trek je rustig het dekglaasje terug waardoor je de te
wensen vloeistof uitstrijkt
Waarom kleuren we sommige preparaten?
Kleuring is noodzakelijk om contrast te bekomen, aangezien niet-gekleurde weefsel ongeveer
dezelfde brekingsindex hebben als glas zou je hierdoor met de gewone lichtmicroscoop weinig
zien
→ Het kleuringsproces geeft kleur aan het weefsel, waardoor de verschillende structuren
kunnen worden onderscheden van elkaar
Welke kleurstof wordt zoal gebruikt voor de kleuring van preparaten?
Voor de kleuring van preparaten worden een tiental kleuringen gebruikt, een veelvuldig
gebruikte overzichtskleuring is de hematoxyline/eosine-kleuring (HE-kleuring). De HE-kleuring
is een combinatie van 2 kleurstoffen, namelijk:
• Hematoxyline: Dit is een basische kleurstof die bekend staat voor zijn affiniteit voor zuur
materiaal in het weefsel, dit zal o.a. de celkernen kleuren
• Eosine: Dit is een zure kleurstof die zich zal binden aan basische bestanddelen
Hoe prepareer je een preparaat d.m.v. kleuring?
1. Fixatie: Behandel het weefsel met een fixatief om het te conserveren
2. Inbedden: Plaats het weefsel in paraffine of een ander medium om het snijden te
vergemakkelijken
3. Snijden: Gebruik een microtoom om coupes te maken en plaats ze op een draagglaasje
4. Rehydrateren: Breng het weefsel terug in een waterig milieu
5. Kleuren: Behandel het weefsel met een geschikte kleurstof
6. Ontwateren: Gebruik een stijgende alcoholreeks om water te verwijderen.
7. Insluiten: Leg een dekglaasje op het preparaat
8. Microscopie: Bekijk de coupe onder de microscoop
Histologie 3
Zeno De Paus
,Zeno De Paus Histologie 1ste Bach. BMW
Deel 1: Microscopische technieken
Welke functies moet een microscoop kunnen vervullen?
Een microscoop moet volgende 3 functies kunnen vervullen:
• Vergroting: De microscoop moet een vergroot beeld van het specimen produceren
• Resolutie: De microscoop moet de details in het beeld scheiden
• Contrast: De microscoop moet de details zichtbaar maken voor het menselijk oog, voor
een camera of voor andere waarnemingsapparaten
Tot hoever kan het oog, een licht- en elektronenmicroscoop inzoomen? Wat is de resolutie?
Waarnemingsapparaat Vergroting Te onderscheiden afstand
Blote oog 1x 100-200µm (0,1-0,2mm)
Lichtmicroscoop 1000x 0,2µm
Elektronenmicroscoop 450 000x 0,1nm
De samengestelde lichtmicroscoop
Wat zijn enkelvoudige microscopen? Wat zijn samengestelde microscopen?
• Enkelvoudige microscopen: Dit zijn microscopen met één lens
• Samengestelde microscopen: Dit zijn microscopen met meerdere lenzen
Wat is het basisprincipe van een samengestelde microscoop?
Het basisprincipe van een samengestelde microscoop is: Het beeld dat door de eerste lens wordt
gevormd, wordt vergroot door de tweede lens, waardoor de vergroting die verkregen wordt, heel
wat hoger is dan bij een enkele lens
De onderdelen van de lichtmicroscoop
Welke delen heeft een lichtmicroscoop? Wat zijn is hun functie?
1. Het oculair: De lens waardoor je door de microscoop kijkt
2. De tubus: Verbindt het oculair met de objectieven
3. De objectieven in de revolver: Verschillende lenzen zitten op
de revolver, je kan veranderen door hieraan te draaien
4. De objecttafel: Plaats waar je het preparaat op legt
5. De kruistafel met nonius: Een verstelbare tafel waarmee je het
preparaat horizontaal en verticaal kunt bewegen
6. De condensor: Focust het licht op het preparaat
7. Het condensor diafragma: Regelt de hoeveelheid licht die de
condensor bereikt
8. De condensor schroef: Verandert de hoogte van de condensor
9. De macrometerschroef: Grote schroef om het preparaat snel
in focus te brengen
10. De micrometerschroef: Dient voor nauwkeurige scherpstelling
11. Het veld diafragma: Regelt hoeveelheid licht in gezichtsveld
12. De lamphouder met lamp: Bevat de lichtbron en zorgt voor verlichting
13. De lichtregeling: Regelt de intensiteit van het licht
14. De voet: Ondersteunt de microscoop en zorgt voor stabiliteit
Histologie 1
,Zeno De Paus Histologie 1ste Bach. BMW
Hoe lees je de informatie van een objectieflens af?
Op een objectieflens staan een aantal nummers gegraveerd, waaronder
de vergroting (… x) en de numerieke aperatuur (NA). De numerieke
aperatuur zegt iets over de globale resolutie van de lens, een hogere NA
wilt dus zeggen dat er een betere resolutie is
Voor het voorbeeld geldt:
• VERGROTING: 63x
• NA: 1,4
Hoe bekom je de vergroting van het uiteindelijke beeld van een microscoop?
Het uiteindelijke beeld bekom je door de vergroting van je objectief te vermenigvuldigen met de
vergroting van je oculair:
VERGR tot = VERGR obj . VERGR ocl
Resolutie en numerieke aperatuur
Wat is de belangrijkste overweging bij het kopen van een microscoop, waarom?
De belangrijkste overweging bij het kopen van een microscoop is de resolutie, dit is het
vermogen van een microscoop om twee punten op een coupe afzonderlijk te kunnen
waarnemen, voor de meeste lichtmicroscopen is deze afstand 0,2𝜇𝑚
Hoe bereken je de resolutie van een microscoop?
De formule van een resolutie van een microscoop is:
𝜆 Berekening van 𝜆
𝑅=
𝑁𝐴 𝑣 ℎ. 𝑐
𝜆= =
Hierbij is: 𝑓 𝐸
R → De resolutie Met:
λ → De golflengte van de belichting h = 6,626 . 10−34 J. s
NA → De numerieke apertuur van de objectieflens c = 3,00.108 m/s
Wat is de numerieke apertuur NA? Hoe bereken je deze
De numerieke apertuur NA is een kwaliteitswaardemeter voor het objectief en kan berekend
worden aan de hand van volgende formule:
𝑁𝐴 = 𝑛 . sin(𝜇)
Er geldt hier: Hoe hoger de numerieke apertuur NA, hoe beter de resolutie zal zijn
Hierbij is:
𝑛 → De brekingsindex van het medium
𝜇 → De halve tophoek van de apertuurkegel
Welke invloed heeft de belichtingsintensiteit om de resolutie?
Een lage belichtingsintensiteit heeft een lage resolutie tot gevolg → Hoge intensiteit is beter
Histologie 2
, Zeno De Paus Histologie 1ste Bach. BMW
Voorbereiding van een preparaat voor lichtmicroscopie
Waarom wordt een orgaan of weefsel eerst gefixeerd? Hoe gebeurt dit?
Het orgaan of weefsel dat, voor microscopisch onderzoek, uit een dier verwijderd wordt kan
gefixeerd worden door perfusie (door de bloedbaan) of door immersie (onderdompelen) in bv.
formaldehyde. Dit doen we om degradatie van het weefsel door bacteriën en enzymen (autolyse)
tegen te gaan
➔ Door fixatie blijft de (ultra)structuur van het weefsel bewaard
Hoe werkt een microtoom?
Een microtoom is een apparaat dat een met paraffine geïmpregneerd weefselblokje in een
houder vasthoudt en hier zeer dunne schijfjes van het weefselblokje afsnijdt
Hoe kunnen we een vloeistof onder de lichtmicroscoop bekijken?
Een vloeistof, zoals bloed of sperma, kan men onder de
lichtmicroscoop gebruiken door het preparaat d.m.v. uitstrijking
te prepareren. Bij uitstrijking zal men het dekglaasje tot aan de te
bekijken vloeistof brengen totdat de vloeistof aan dit dekglaasje
hangt. Nu trek je rustig het dekglaasje terug waardoor je de te
wensen vloeistof uitstrijkt
Waarom kleuren we sommige preparaten?
Kleuring is noodzakelijk om contrast te bekomen, aangezien niet-gekleurde weefsel ongeveer
dezelfde brekingsindex hebben als glas zou je hierdoor met de gewone lichtmicroscoop weinig
zien
→ Het kleuringsproces geeft kleur aan het weefsel, waardoor de verschillende structuren
kunnen worden onderscheden van elkaar
Welke kleurstof wordt zoal gebruikt voor de kleuring van preparaten?
Voor de kleuring van preparaten worden een tiental kleuringen gebruikt, een veelvuldig
gebruikte overzichtskleuring is de hematoxyline/eosine-kleuring (HE-kleuring). De HE-kleuring
is een combinatie van 2 kleurstoffen, namelijk:
• Hematoxyline: Dit is een basische kleurstof die bekend staat voor zijn affiniteit voor zuur
materiaal in het weefsel, dit zal o.a. de celkernen kleuren
• Eosine: Dit is een zure kleurstof die zich zal binden aan basische bestanddelen
Hoe prepareer je een preparaat d.m.v. kleuring?
1. Fixatie: Behandel het weefsel met een fixatief om het te conserveren
2. Inbedden: Plaats het weefsel in paraffine of een ander medium om het snijden te
vergemakkelijken
3. Snijden: Gebruik een microtoom om coupes te maken en plaats ze op een draagglaasje
4. Rehydrateren: Breng het weefsel terug in een waterig milieu
5. Kleuren: Behandel het weefsel met een geschikte kleurstof
6. Ontwateren: Gebruik een stijgende alcoholreeks om water te verwijderen.
7. Insluiten: Leg een dekglaasje op het preparaat
8. Microscopie: Bekijk de coupe onder de microscoop
Histologie 3
