Hoofdstuk 2: DNA-sequentiebepaling
Volledige samenvatting
1. Inleiding: waarom DNA-sequentiebepaling?
● Doel: DNA is de drager van genetische informatie, samengevat in de volgorde van de basen. Om die informatie
te kunnen gebruiken (en fouten/mutaties te detecteren) moet je die volgorde (sequentie) kunnen bepalen.
● Drie grote toepassingscategorieën van sequencing (belangrijk om steeds voor ogen te houden: welke je kiest
hangt af van de vraagstelling):
○ De novo sequencing: de sequentie van een genoom bepalen wanneer we nog niet weten hoe het in elkaar
zit (bv. het allereerste humaan genoom, of het SARS-CoV-2-genoom bij het begin van de pandemie). 'De
novo' = helemaal vanaf nul.
○ Resequencing: veruit de meest voorkomende toepassing (99,9% van de gevallen) => de sequentie van een
staal bepalen en vergelijken met een reeds gekend referentiegenoom, op zoek naar verschillen (SNP's,
mutaties). Toepassingen: diagnose van aangeboren aandoeningen, farmacogenetica, niet-invasieve
prenatale testen (NIPT), verificatie van moleculair-biologische constructen.
○ Sequencing als teller: sequencing wordt hier niet gebruikt om de sequentie zelf te kennen, maar om te
tellen hoeveel moleculen van een bepaald type aanwezig zijn
(bv. RNA-seq: hoeveel cDNA-moleculen van gen 1, gen 2, ... aanwezig zijn = maat voor expressieniveau).
● Belangrijke nuance bij resequencing: je hoeft niet altijd het volledige genoom te bekijken: de keuze hangt af
van de vraag.
○ Bij kanker liggen coderende mutaties bijna altijd in exonen (~1,5% van het genoom) → whole exome
sequencing kan dan volstaan en is goedkoper.
○ Weet je dat de mutatie op één chromosoom ligt → targeted sequencing van dat ene chromosoom.
○ Wil je enkel naar RNA-expressie kijken → transcriptoom-sequencing (CDNA).
2. Eerste generatie sequencing
2.1 Maxam-Gilbert (chemische klievingsmethode): historisch
● Ontwikkeld eind jaren '70, Nobelprijs 1980 (samen met Sanger): niet meer gebruikt, louter ter
illustratie/historisch belang.
● Principe: een DNA-fragment wordt aan beide uiteinden radioactief gelabeld (T4 DNA-kinase); één uiteinde
wordt met een restrictie-enzym verwijderd. Vervolgens wordt het DNA in 4 aparte reactiebuisjes blootgesteld
aan chemische reacties die specifiek maar niet volledig knippen na een G, na een A-of-G, na een C-of-T, of na
een C (de reacties zijn zo getitreerd dat slechts een fractie van elke mogelijke plaats effectief knipt).
● Resultaat wordt op een hoge-resolutie agarose-gel gescheiden + autoradiografie → de sequentie wordt
afgeleid uit het patroon van welke 'laan' (G, A+G, C+T, of C) op elke hoogte signaal geeft.
2.2 Sanger-sequencing (dideoxy-terminatie)
● Nog steeds de gouden standaard
○ wanneer je 100% zekerheid wil over een specifieke mutatie in een specifiek staal, voor kleine projecten (1-2
loci),
○ en voor verificatie van klonering/constructen (dagelijks gebruikt in labo's).
● Basisprincipe: reactiemengsel met het DNA-fragment (uit kloning of PCR), een primer, dNTP's, DNA-
polymerase, plus een kleine hoeveelheid ddNTP's (dideoxynucleotiden).
,● Waarom ddNTP's de reactie stoppen: normale dNTP's hebben een OH-groep op de 3'-koolstof, essentieel om
de volgende base te kunnen aanhechten (ketenverlenging). Een ddNTP mist deze OH-groep → zodra een ddNTP
wordt ingebouwd, kan de keten niet verder verlengd worden → terminatie.
● Doordat de polymerase willekeurig kiest tussen een normale dNTP en het aanwezige ddNTP op elke positie
waar die specifieke base nodig is, ontstaat een mengsel van fragmenten van alle mogelijke lengtes, elk
eindigend op dezelfde, gekende base.
● Klassiek (radioactief/4 aparte reacties): 4 aparte reactiebuisjes (één per ddNTP-type), elk gescheiden op een
aparte baan van een agarosegel => arbeidsintensief (gels zelf gieten) en met radioactieve labeling.
● Moderne variant (fluorescent, capillair): elke ddNTP draagt een eigen fluorescente kleur (A/C/G/T elk een
andere kleur) → alle 4 reacties kunnen samen in 1 buisje, gescheiden op een capillair i.p.v. een gel-baan. Een
detector aan het einde van het capillair leest het fluorescentiesignaal af in volgorde van fragmentgrootte
(kleinste fragment het eerst, komt overeen met het 5'-uiteinde).
● Introductie van capillaire systemen liet parallellisatie toe: 96 sanger-reacties tegelijk op één toestel, sequentie
van 96 fragmenten op één dag.
● Beperkingen: leeslengte beperkt tot ~500 (tot max. ~1200-1300) nucleotiden per reactie; moeite met
repetitieve sequenties; om zeker te zijn, sequencet men vaak zowel de forward als de reverse streng (2 aparte
reacties, moeten in theorie 100% overeenkomen).
2.3 Het elektroferogram aflezen
● De eerste ~20-30 basen na de sequencing-primer zijn moeilijk betrouwbaar af te lezen (signaal vaak te sterk,
slechte scheiding), pas daarna wordt het aflezen betrouwbaarder.
● Phred-score: een kwaliteitsscore per afgelezen base, genoemd naar het Phred-programma. Phred 10 = 1 kans
op 10 dat de base fout is (onaanvaardbaar); Phred 20 = 1 kans op 100 (nog steeds onvoldoende); in de praktijk
wil je minstens Phred 36, idealiter Phred 40 of hoger.
● Mutatiedetectie op het elektroferogram: bij een heterozygote patiënt zie je op één positie twee overlappende
pieken (twee verschillende basen tegelijk) => dit komt doordat je DNA van een diploïde patiënt sequencet: het
ene allel geeft de ene base, het andere allel de andere base, en beide worden gelijktijdig afgelezen op diezelfde
positie.
3. Het Human Genome Project (HGP)
● Grootste multinationale biologische project ooit gestart 1990, geleid door Francis Collins, ~3 miljard dollar,
~20 centra wereldwijd, draft-sequentie gepubliceerd in 2001, eerste 'finale' sequentie in 2003 (~13 jaar in
totaal). Het gesequencede genoom was een mengsel van meerdere individuen (bloeddonoren), niet van 1
persoon.
3.1 Methode: hiërarchical shotgun sequencing
● DNA werd gefragmenteerd en eerst gekloneerd in steeds kleinere vectoren: YAC's (Yeast Artificial
Chromosome, tot ~2 miljoen baseparen per fragment), dan BAC's (Bacterial Artificial Chromosome, ~100.000
bp), dan cosmiden (kleinste fragmenten) die laatste werden uiteindelijk gesequenced.
● Primer walking: sequencing start vanaf de gekende cosmide-sequentie het insert in; na de eerste 600 basen
wordt een nieuwe, specifieke primer ontworpen om de volgende 600 basen te lezen, enzovoort.
● Open science avant la lettre: elke 24 uur werden nieuw gegenereerde sequenties automatisch vrijgegeven aan
de wetenschappelijke gemeenschap, nog vóór het project afgerond was.
3.2 Celera Genomics het parallelle, commerciële project
,● Craig Venter (later ook bekend van de eerste synthetische bacterie, zie hoofdstuk 8) richtte Celera op en
sequenceerde onafhankelijk, parallel aan het HGP, het genoom van 5 individuen (waaronder zijn eigen
genoom).
● Methode: whole genome shotgun sequencing het genoom werd in willekeurige, kleine stukjes gebroken en
direct gesequenced, waarna een supercomputer (specifiek hiervoor ontwikkeld) alle fragmenten achteraf terug
in elkaar puzzelde geen tussenstap via BAC's/cosmiden zoals bij het HGP. Gebruikte 330 Sanger-sequencing-
toestellen + colony-picking-robots.
● Publiceerde zijn resultaten (2001) gelijktijdig met het publieke consortium met als belangrijk verschil dat het
publieke project zijn data continu, dagelijks deelde, terwijl Celera dit niet deed.
3.3 Impact van het Human Genome Project
● Technologische ontwikkeling: automatisering van sequencing (van individuele gels naar capillaire elektroforese
met 96 capillairen tegelijk) → sterk gedaalde kost per base.
● Geboorte van bio-informatica: de nood om al die sequenties te annoteren en te begrijpen gaf aanleiding tot
het vakgebied bio-informatica.
● Open science/open data-cultuur: data continu gedeeld via databanken zoals NCBI, Ensembl, UCSC een cultuur
die zich later ook vertaalt naar preprints (bv. bioRxiv) vóór peer review.
● Basis voor resequencing en comparative genomics: eenmaal er een referentiegenoom is, wordt elke volgende
sequencing-taak (resequencing) veel eenvoudiger; vergelijking tussen individuen, populaties, species, patiënten
vs. controles werd mogelijk (evolutie, geconserveerde processen, GWAS, ...).
● Belangrijke nuance: de 2001/2003-sequentie was 99% compleet, niet 100% sommige regio's (bv. centromeren)
waren onmogelijk te sequencen met Sanger. Pas met third generation (long-read) sequencing kon recent de
eerste volledige, gapless telomeer-tot-telomeer (T2T)-assemblage gemaakt worden.
● Klinische/maatschappelijke toepassingen die uit het HGP voortvloeiden: personalized/precision medicine,
farmacogenomica (voorspellen hoe snel iemand een medicijn metaboliseert bv. companion diagnostics om
patiënten met een risicovolle mutatie uit te sluiten van een medicijn zonder het medicijn helemaal van de
markt te moeten halen), GWAS (inzicht in complexe, multifactoriële aandoeningen zoals diabetes), targeted
therapy (bv. EGFR-inhibitoren bij longkanker met een specifieke mutatie).
● Ethische aandachtspunten: risico's van bekende genoomsequenties, bv. bij verzekeringsmaatschappijen
(wettelijk verboden om genetische profilering te vragen bij het afsluiten van polissen, bv. relevant bij BRCA-
mutatiedragers).
4. Second Generation / Next Generation Sequencing (NGS)
● Doel: veel hogere doorvoer aan (veel) lagere kost dan Sanger
○ het initiële streefdoel was 1 humaan genoom per toestel per dag voor <$1000 ('het $1000-genoom').
Vandaag (2025/2026): ~€300-400 per genoom bij Illumina, met nieuwere systemen richting €100.
● Kernprincipe: short-read sequencing = korte fragmentjes (35-150 bp) worden gelezen, en het volledige
genoom wordt daarna computationeel terug in elkaar gepuzzeld (bij resequencing: gemapt op een
referentiegenoom).
● Drie technologische vereisten om dit te bereiken (t.o.v. Sanger):
○ (1) massale parallellisatie (miljoenen sequenties tegelijk i.p.v. 96),
○ (2) klonale in-vitro-amplificatie (in plaats van klonering in bacteriën/gist),
○ (3) miniaturisatie en automatisering van de hele workflow.
, ● Marktdynamiek: zeer snel evoluerend, competitief veld: Illumina (via de overname van Solexa in 2007) is
momenteel marktleider (~80-90%), maar met het verlopen van patenten komen steeds meer, goedkopere
alternatieven op de markt (Ion Torrent, MGI/Complete Genomics, Ultima Genomics, Element
Biosciences/Aviti).
● Vier gemeenschappelijke stappen bij alle NGS-platformen: (1) aanmaak van een DNA-library, (2) klonale in-
vitro-amplificatie, (3) sequencing-reactie, (4) data-analyse.
4.1 Stap 1: Aanmaak van de DNA-library
● Types libraries (afhankelijk van de toepassing): whole genome sequencing library, exome sequencing library
(enkel coderende sequenties), amplicon sequencing (bv. gerichte farmacogenomica-loci), CDNA library (RNA-
seq), DNA-immunoprecipitatie-library (MeDIP-seq, ChIP-seq, Hi-C, ...).
● Workflow:
○ Kwaliteitscontrole van het DNA: concentratie/zuiverheid via spectrofotometrie
(260/280: contaminatie eiwitten: ~1,8 is goed en 260/230-ratio's: zouten en organische stoffen: ~2,0–2,2),
intactheid via capillaire elektroforese of een gel.
○ Fragmentatie:
▪ Sonicatie
▪ nebulisatie (DNA-oplossing door een klein buisje geperst => vergelijkbaar met een spuitbus: genereert
kleine druppeltjes met een beperkte hoeveelheid DNA, wat het fragmenteert),
▪ of enzymatisch (DNase, knipt vrij random).
○ End repair: fragmenten blunt-end maken
▪ 5'-uiteinde fosforyleren
▪ een niet-template A wordt aan het 3'-uiteinde toegevoegd
▪ (via de non-template-activiteit van Taq-polymerase) om efficiëntere (niet-blunt) ligatie met adaptors
mogelijk te maken (adaptor draagt een complementair T'tje).
○ Adaptor-ligatie: nodig voor PCR-amplificatie van de library, en kunnen indices/barcodes dragen.
▪ Een beperkt aantal PCR-cycli met een high-fidelity polymerase met minimale GC-bias amplificeert de
library (belangrijk om geen vertekening in GC-rijke/arme fragmenten of nieuwe mutaties te
introduceren).
● Alternatief voor fragmentatie + adaptor-ligatie: tagmentatie
○ =een aangepast transposase-enzym (afgeleid van een transposon, weinig sequentie-specificiteit) wordt
geladen met adaptor-sequenties (i.p.v. het normale transposon-DNA) en insereert deze op willekeurige
plaatsen in het genoom
▪ combineert fragmentatie en adaptor-plaatsing in 1 stap. De concentratie transposase bepaalt de
gemiddelde fragmentgrootte (hogere concentratie = meer insertie-events = kortere fragmenten).
● Size selection: elke library bevat te veel te grote én te kleine fragmenten (beide problematisch: kleine
fragmenten amplificeren preferentieel maar geven weinig info, grote fragmenten geven problemen bij cluster-
generatie).
○ Klassiek via gel-excisie (moeilijk te paralleliseren);
○ Modern via Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) met paramagnetische beads:
▪ Polyethyleenglycol (PEG) fungeert als 'crowding agent': trekt water weg van het (negatief geladen)
DNA; zouten in de oplossing nemen de plaats van water in en laten het DNA precipiteren op de beads.
▪ Bij een lage PEG-concentratie precipiteren enkel de grootste fragmenten op de beads (magnetisch
weggehaald, weggegooid).
▪ Bij een hogere PEG-concentratie precipiteren ook kleinere fragmenten => het supernatant (met de
kleinste fragmenten) wordt weggegooid, en wat op de beads blijft zitten (tussen de twee
grensgroottes) is de gewenste fragmentrange.
Volledige samenvatting
1. Inleiding: waarom DNA-sequentiebepaling?
● Doel: DNA is de drager van genetische informatie, samengevat in de volgorde van de basen. Om die informatie
te kunnen gebruiken (en fouten/mutaties te detecteren) moet je die volgorde (sequentie) kunnen bepalen.
● Drie grote toepassingscategorieën van sequencing (belangrijk om steeds voor ogen te houden: welke je kiest
hangt af van de vraagstelling):
○ De novo sequencing: de sequentie van een genoom bepalen wanneer we nog niet weten hoe het in elkaar
zit (bv. het allereerste humaan genoom, of het SARS-CoV-2-genoom bij het begin van de pandemie). 'De
novo' = helemaal vanaf nul.
○ Resequencing: veruit de meest voorkomende toepassing (99,9% van de gevallen) => de sequentie van een
staal bepalen en vergelijken met een reeds gekend referentiegenoom, op zoek naar verschillen (SNP's,
mutaties). Toepassingen: diagnose van aangeboren aandoeningen, farmacogenetica, niet-invasieve
prenatale testen (NIPT), verificatie van moleculair-biologische constructen.
○ Sequencing als teller: sequencing wordt hier niet gebruikt om de sequentie zelf te kennen, maar om te
tellen hoeveel moleculen van een bepaald type aanwezig zijn
(bv. RNA-seq: hoeveel cDNA-moleculen van gen 1, gen 2, ... aanwezig zijn = maat voor expressieniveau).
● Belangrijke nuance bij resequencing: je hoeft niet altijd het volledige genoom te bekijken: de keuze hangt af
van de vraag.
○ Bij kanker liggen coderende mutaties bijna altijd in exonen (~1,5% van het genoom) → whole exome
sequencing kan dan volstaan en is goedkoper.
○ Weet je dat de mutatie op één chromosoom ligt → targeted sequencing van dat ene chromosoom.
○ Wil je enkel naar RNA-expressie kijken → transcriptoom-sequencing (CDNA).
2. Eerste generatie sequencing
2.1 Maxam-Gilbert (chemische klievingsmethode): historisch
● Ontwikkeld eind jaren '70, Nobelprijs 1980 (samen met Sanger): niet meer gebruikt, louter ter
illustratie/historisch belang.
● Principe: een DNA-fragment wordt aan beide uiteinden radioactief gelabeld (T4 DNA-kinase); één uiteinde
wordt met een restrictie-enzym verwijderd. Vervolgens wordt het DNA in 4 aparte reactiebuisjes blootgesteld
aan chemische reacties die specifiek maar niet volledig knippen na een G, na een A-of-G, na een C-of-T, of na
een C (de reacties zijn zo getitreerd dat slechts een fractie van elke mogelijke plaats effectief knipt).
● Resultaat wordt op een hoge-resolutie agarose-gel gescheiden + autoradiografie → de sequentie wordt
afgeleid uit het patroon van welke 'laan' (G, A+G, C+T, of C) op elke hoogte signaal geeft.
2.2 Sanger-sequencing (dideoxy-terminatie)
● Nog steeds de gouden standaard
○ wanneer je 100% zekerheid wil over een specifieke mutatie in een specifiek staal, voor kleine projecten (1-2
loci),
○ en voor verificatie van klonering/constructen (dagelijks gebruikt in labo's).
● Basisprincipe: reactiemengsel met het DNA-fragment (uit kloning of PCR), een primer, dNTP's, DNA-
polymerase, plus een kleine hoeveelheid ddNTP's (dideoxynucleotiden).
,● Waarom ddNTP's de reactie stoppen: normale dNTP's hebben een OH-groep op de 3'-koolstof, essentieel om
de volgende base te kunnen aanhechten (ketenverlenging). Een ddNTP mist deze OH-groep → zodra een ddNTP
wordt ingebouwd, kan de keten niet verder verlengd worden → terminatie.
● Doordat de polymerase willekeurig kiest tussen een normale dNTP en het aanwezige ddNTP op elke positie
waar die specifieke base nodig is, ontstaat een mengsel van fragmenten van alle mogelijke lengtes, elk
eindigend op dezelfde, gekende base.
● Klassiek (radioactief/4 aparte reacties): 4 aparte reactiebuisjes (één per ddNTP-type), elk gescheiden op een
aparte baan van een agarosegel => arbeidsintensief (gels zelf gieten) en met radioactieve labeling.
● Moderne variant (fluorescent, capillair): elke ddNTP draagt een eigen fluorescente kleur (A/C/G/T elk een
andere kleur) → alle 4 reacties kunnen samen in 1 buisje, gescheiden op een capillair i.p.v. een gel-baan. Een
detector aan het einde van het capillair leest het fluorescentiesignaal af in volgorde van fragmentgrootte
(kleinste fragment het eerst, komt overeen met het 5'-uiteinde).
● Introductie van capillaire systemen liet parallellisatie toe: 96 sanger-reacties tegelijk op één toestel, sequentie
van 96 fragmenten op één dag.
● Beperkingen: leeslengte beperkt tot ~500 (tot max. ~1200-1300) nucleotiden per reactie; moeite met
repetitieve sequenties; om zeker te zijn, sequencet men vaak zowel de forward als de reverse streng (2 aparte
reacties, moeten in theorie 100% overeenkomen).
2.3 Het elektroferogram aflezen
● De eerste ~20-30 basen na de sequencing-primer zijn moeilijk betrouwbaar af te lezen (signaal vaak te sterk,
slechte scheiding), pas daarna wordt het aflezen betrouwbaarder.
● Phred-score: een kwaliteitsscore per afgelezen base, genoemd naar het Phred-programma. Phred 10 = 1 kans
op 10 dat de base fout is (onaanvaardbaar); Phred 20 = 1 kans op 100 (nog steeds onvoldoende); in de praktijk
wil je minstens Phred 36, idealiter Phred 40 of hoger.
● Mutatiedetectie op het elektroferogram: bij een heterozygote patiënt zie je op één positie twee overlappende
pieken (twee verschillende basen tegelijk) => dit komt doordat je DNA van een diploïde patiënt sequencet: het
ene allel geeft de ene base, het andere allel de andere base, en beide worden gelijktijdig afgelezen op diezelfde
positie.
3. Het Human Genome Project (HGP)
● Grootste multinationale biologische project ooit gestart 1990, geleid door Francis Collins, ~3 miljard dollar,
~20 centra wereldwijd, draft-sequentie gepubliceerd in 2001, eerste 'finale' sequentie in 2003 (~13 jaar in
totaal). Het gesequencede genoom was een mengsel van meerdere individuen (bloeddonoren), niet van 1
persoon.
3.1 Methode: hiërarchical shotgun sequencing
● DNA werd gefragmenteerd en eerst gekloneerd in steeds kleinere vectoren: YAC's (Yeast Artificial
Chromosome, tot ~2 miljoen baseparen per fragment), dan BAC's (Bacterial Artificial Chromosome, ~100.000
bp), dan cosmiden (kleinste fragmenten) die laatste werden uiteindelijk gesequenced.
● Primer walking: sequencing start vanaf de gekende cosmide-sequentie het insert in; na de eerste 600 basen
wordt een nieuwe, specifieke primer ontworpen om de volgende 600 basen te lezen, enzovoort.
● Open science avant la lettre: elke 24 uur werden nieuw gegenereerde sequenties automatisch vrijgegeven aan
de wetenschappelijke gemeenschap, nog vóór het project afgerond was.
3.2 Celera Genomics het parallelle, commerciële project
,● Craig Venter (later ook bekend van de eerste synthetische bacterie, zie hoofdstuk 8) richtte Celera op en
sequenceerde onafhankelijk, parallel aan het HGP, het genoom van 5 individuen (waaronder zijn eigen
genoom).
● Methode: whole genome shotgun sequencing het genoom werd in willekeurige, kleine stukjes gebroken en
direct gesequenced, waarna een supercomputer (specifiek hiervoor ontwikkeld) alle fragmenten achteraf terug
in elkaar puzzelde geen tussenstap via BAC's/cosmiden zoals bij het HGP. Gebruikte 330 Sanger-sequencing-
toestellen + colony-picking-robots.
● Publiceerde zijn resultaten (2001) gelijktijdig met het publieke consortium met als belangrijk verschil dat het
publieke project zijn data continu, dagelijks deelde, terwijl Celera dit niet deed.
3.3 Impact van het Human Genome Project
● Technologische ontwikkeling: automatisering van sequencing (van individuele gels naar capillaire elektroforese
met 96 capillairen tegelijk) → sterk gedaalde kost per base.
● Geboorte van bio-informatica: de nood om al die sequenties te annoteren en te begrijpen gaf aanleiding tot
het vakgebied bio-informatica.
● Open science/open data-cultuur: data continu gedeeld via databanken zoals NCBI, Ensembl, UCSC een cultuur
die zich later ook vertaalt naar preprints (bv. bioRxiv) vóór peer review.
● Basis voor resequencing en comparative genomics: eenmaal er een referentiegenoom is, wordt elke volgende
sequencing-taak (resequencing) veel eenvoudiger; vergelijking tussen individuen, populaties, species, patiënten
vs. controles werd mogelijk (evolutie, geconserveerde processen, GWAS, ...).
● Belangrijke nuance: de 2001/2003-sequentie was 99% compleet, niet 100% sommige regio's (bv. centromeren)
waren onmogelijk te sequencen met Sanger. Pas met third generation (long-read) sequencing kon recent de
eerste volledige, gapless telomeer-tot-telomeer (T2T)-assemblage gemaakt worden.
● Klinische/maatschappelijke toepassingen die uit het HGP voortvloeiden: personalized/precision medicine,
farmacogenomica (voorspellen hoe snel iemand een medicijn metaboliseert bv. companion diagnostics om
patiënten met een risicovolle mutatie uit te sluiten van een medicijn zonder het medicijn helemaal van de
markt te moeten halen), GWAS (inzicht in complexe, multifactoriële aandoeningen zoals diabetes), targeted
therapy (bv. EGFR-inhibitoren bij longkanker met een specifieke mutatie).
● Ethische aandachtspunten: risico's van bekende genoomsequenties, bv. bij verzekeringsmaatschappijen
(wettelijk verboden om genetische profilering te vragen bij het afsluiten van polissen, bv. relevant bij BRCA-
mutatiedragers).
4. Second Generation / Next Generation Sequencing (NGS)
● Doel: veel hogere doorvoer aan (veel) lagere kost dan Sanger
○ het initiële streefdoel was 1 humaan genoom per toestel per dag voor <$1000 ('het $1000-genoom').
Vandaag (2025/2026): ~€300-400 per genoom bij Illumina, met nieuwere systemen richting €100.
● Kernprincipe: short-read sequencing = korte fragmentjes (35-150 bp) worden gelezen, en het volledige
genoom wordt daarna computationeel terug in elkaar gepuzzeld (bij resequencing: gemapt op een
referentiegenoom).
● Drie technologische vereisten om dit te bereiken (t.o.v. Sanger):
○ (1) massale parallellisatie (miljoenen sequenties tegelijk i.p.v. 96),
○ (2) klonale in-vitro-amplificatie (in plaats van klonering in bacteriën/gist),
○ (3) miniaturisatie en automatisering van de hele workflow.
, ● Marktdynamiek: zeer snel evoluerend, competitief veld: Illumina (via de overname van Solexa in 2007) is
momenteel marktleider (~80-90%), maar met het verlopen van patenten komen steeds meer, goedkopere
alternatieven op de markt (Ion Torrent, MGI/Complete Genomics, Ultima Genomics, Element
Biosciences/Aviti).
● Vier gemeenschappelijke stappen bij alle NGS-platformen: (1) aanmaak van een DNA-library, (2) klonale in-
vitro-amplificatie, (3) sequencing-reactie, (4) data-analyse.
4.1 Stap 1: Aanmaak van de DNA-library
● Types libraries (afhankelijk van de toepassing): whole genome sequencing library, exome sequencing library
(enkel coderende sequenties), amplicon sequencing (bv. gerichte farmacogenomica-loci), CDNA library (RNA-
seq), DNA-immunoprecipitatie-library (MeDIP-seq, ChIP-seq, Hi-C, ...).
● Workflow:
○ Kwaliteitscontrole van het DNA: concentratie/zuiverheid via spectrofotometrie
(260/280: contaminatie eiwitten: ~1,8 is goed en 260/230-ratio's: zouten en organische stoffen: ~2,0–2,2),
intactheid via capillaire elektroforese of een gel.
○ Fragmentatie:
▪ Sonicatie
▪ nebulisatie (DNA-oplossing door een klein buisje geperst => vergelijkbaar met een spuitbus: genereert
kleine druppeltjes met een beperkte hoeveelheid DNA, wat het fragmenteert),
▪ of enzymatisch (DNase, knipt vrij random).
○ End repair: fragmenten blunt-end maken
▪ 5'-uiteinde fosforyleren
▪ een niet-template A wordt aan het 3'-uiteinde toegevoegd
▪ (via de non-template-activiteit van Taq-polymerase) om efficiëntere (niet-blunt) ligatie met adaptors
mogelijk te maken (adaptor draagt een complementair T'tje).
○ Adaptor-ligatie: nodig voor PCR-amplificatie van de library, en kunnen indices/barcodes dragen.
▪ Een beperkt aantal PCR-cycli met een high-fidelity polymerase met minimale GC-bias amplificeert de
library (belangrijk om geen vertekening in GC-rijke/arme fragmenten of nieuwe mutaties te
introduceren).
● Alternatief voor fragmentatie + adaptor-ligatie: tagmentatie
○ =een aangepast transposase-enzym (afgeleid van een transposon, weinig sequentie-specificiteit) wordt
geladen met adaptor-sequenties (i.p.v. het normale transposon-DNA) en insereert deze op willekeurige
plaatsen in het genoom
▪ combineert fragmentatie en adaptor-plaatsing in 1 stap. De concentratie transposase bepaalt de
gemiddelde fragmentgrootte (hogere concentratie = meer insertie-events = kortere fragmenten).
● Size selection: elke library bevat te veel te grote én te kleine fragmenten (beide problematisch: kleine
fragmenten amplificeren preferentieel maar geven weinig info, grote fragmenten geven problemen bij cluster-
generatie).
○ Klassiek via gel-excisie (moeilijk te paralleliseren);
○ Modern via Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) met paramagnetische beads:
▪ Polyethyleenglycol (PEG) fungeert als 'crowding agent': trekt water weg van het (negatief geladen)
DNA; zouten in de oplossing nemen de plaats van water in en laten het DNA precipiteren op de beads.
▪ Bij een lage PEG-concentratie precipiteren enkel de grootste fragmenten op de beads (magnetisch
weggehaald, weggegooid).
▪ Bij een hogere PEG-concentratie precipiteren ook kleinere fragmenten => het supernatant (met de
kleinste fragmenten) wordt weggegooid, en wat op de beads blijft zitten (tussen de twee
grensgroottes) is de gewenste fragmentrange.
