Practica immunologie – Theorie
Inhoud
Hoofdstuk 1: Eigenschappen van antistoffen .............................................................. 2
1. De antigeen-antistofbinding ............................................................................... 2
1.1 Antigeen ...................................................................................................... 2
1.2 Antistof ....................................................................................................... 3
1.3 Antistof – antigeen interactie ......................................................................... 3
2. Affiniteit en aviditeit ........................................................................................... 4
2.1 Affiniteit ...................................................................................................... 4
2.2 Aviditeit ....................................................................................................... 5
Hoofdstuk 2: Aantonen van antistoffen ...................................................................... 6
1. Precipitatie ....................................................................................................... 7
1.1 Algemeen principe ....................................................................................... 7
1.2 Precipitatiereacties in gel in afwezigheid van elektroforese ............................. 8
1.3 Precipitatiereacties in gel in aanwezigheid van elektroforese ......................... 10
2. Agglutinatie..................................................................................................... 11
2.1 Algemeen principe ..................................................................................... 11
2.2 Ringagglutinatie: ringtest ............................................................................ 13
2.3 Snelle agglutinatie of draagglas-agglutinatie ................................................ 14
2.4 Trage agglutinatie of buisjes-agglutinatie ..................................................... 15
2.5 Coombs’ test ............................................................................................. 16
2.6 Hemagglutinatie-inhibitie (HI) ..................................................................... 17
3. Neutralisatietest ............................................................................................. 19
4. Complementbindingsreactie ............................................................................ 20
4.1 Complement systeem ................................................................................ 20
4.2 Complementbindingstest ........................................................................... 20
5. Ligandbindingstesten ...................................................................................... 21
5.1 Enzym-immunoassays ............................................................................... 21
5.2 Immunoblotting of Western blotting ............................................................ 29
5.3 Fluorescentie-immunoassay (FIA) ............................................................... 31
Hoofdstuk 3: Evaluatie van aantal en functies van immuuncellen .............................. 33
1. Isolatie van leukocyten (- populaties of subpopulaties) uit bloed of weefsels ....... 33
1
, 1.1 Isolatie op basis van celdensiteit ............................................................... 33
1.2 Isolatie op basis van cellading .................................................................... 35
1.3 Isolatie op basis van fagocyterende eigenschappen ................................... 36
1.4 Isolatie op basis van adhesie ...................................................................... 36
1.5 Isolatie op basis van membraanmerkers .................................................... 36
2. Detectie van immuuncellen ............................................................................. 43
3. Functietesten .................................................................................................. 43
3.1 Functietesten voor lymfocyten ................................................................... 44
3.2 Functietesten voor lymfocyten, monocyten/macrofagen en granulocyten . 47
3.3 Functietesten voor monocyten / macrofagen en granulocyten ................... 52
Hoofdstuk 1: Eigenschappen van antistoffen
1. De antigeen-antistofbinding
1.1 Antigeen
• “vreemd partikel”
• In staat afweerreactie op te wekken
• ≠ epitoop: deel van een macromolecule (antigen) dat herkend kan worden door
antilichamen, B-cellen en T-cellen
• Gebonden door As
• Monovalent <> multivalent Ag
• Monoklonaal <> polyklonaal As
o Monoklonaal = verzameling van As gericht tegen 1 epitoop van hetzelfde
Ag
o Polyklonaal (antiserum) = verzameling van As gericht tegen veschillende
epitopen van hetzelfde Ag
• Kenmerken
o Grootte ↑
o Complexiteit ↑
o Structurele stabiliteit ↑ Immunogeniciteit ↑
o Afbreekbaarheid ↑
o Lichaamsvreemd ↑
2
,1.2 Antistof
• = immunoglobuline
• 2 zware ketens (α, δ, ε, γ, µ)
• Constant en variabel gedeelte
• Antigeenbindingsplaats
• Scharniergebied
• Disulfide bruggen
1.3 Antistof – antigeen interactie
• Basis van de immunochemie
• Dmv zwakke niet-covalente krachten
o Worden belangrijk wanneer Ag en As elkaar dicht benaderen
o Primaire binding Ag-As: zeer snel
o Secundaire binding Ag-As: trager
Primaire binding
• Van der Waals-krachten
o Aantrekkingskracht tussen oscillerende dipolen (afwisselend + en -) in
atomen
o Werkzaam tot afstand 1000 Å
o OE met de 7de macht van de afstand tussen moleculen
o Zwakker dan Coulombse krachten
• Coulombse krachten
o Elektrostatische krachten
o Tegengesteld geladen ionengroepen trekken elkaar aan
o Werkzaam tot afstand 100 Å
o OE met de 2de macht van de afstand tussen moleculen
o Belangrijk in het begin van de binding tussen Ag-As
Secundaire binding
• Waterstofbruggen
o Zwakke & omkeerbare interacties tussen hydrofiele groepen (-OH, -NH2 en
-COOH)
o Minder vlug in een waterig milieu → water neemt deel aan vorming van
waterstofbruggen
o Werkzaam over zeer korte afstand (1-1,5 Å)
o Geringe bijdrage in stabiliteit Ag-As binding
• Apolaire of hydrofobe krachten
o Interacties tussen apolaire groepen
o Werkzaam over korte afstand
o Belangrijk voor de vorming van Ag-As complexen
➔ water wordt uitgedreven
3
, Kost minder energie om Ag-As binding te verhinderen tijdens het proces dan om een
bestaande binding te verbreken
Hoe langer de binding kan plaatsgrijpen, hoe sterker de binding
Evenwichtsreactie
• Ka = reactieconstante bij associatie → snel
• Kd = reactieconstante bij dissociatie → wisselend verloop
2. Affiniteit en aviditeit
2.1 Affiniteit
Definitie
• Vermogen van 1 antistofmolecule om aan 1 epitoop te binden
• = som van alle non-covalente bindingen
Affiniteitsconstante
• Evenwichtsconstante: Ka
• Maat voor affiniteit van een As voor 1 epitoop van een Ag
• Hoge affiniteitsconstante: weinig Ag nodig om 50% van de bindingsplaatsen van
de As te verzadigen
• Zegt niet over de snelheid waarmee de binding gebeurt
• Wordt beïnvloed door:
o Afstand (Å)
o Krachten
o Factoren
▪ pH
• optimaal: 6,5-7
• mAs zijn gevoelig aan pH veranderingen
• pH veranderingen hebben sterke impact op Coulombse
krachten
▪ Ionensterkte
• Zoutconcentratie ↓ → Ka ↑
• Zoutconcentratie ↑
o → Ka ↓ indien binding vooral uit Coulombse krachten
bestaat
o → Ka ↑ indien binding vooral uit hydrofobe bindingen
bestaat
4
Inhoud
Hoofdstuk 1: Eigenschappen van antistoffen .............................................................. 2
1. De antigeen-antistofbinding ............................................................................... 2
1.1 Antigeen ...................................................................................................... 2
1.2 Antistof ....................................................................................................... 3
1.3 Antistof – antigeen interactie ......................................................................... 3
2. Affiniteit en aviditeit ........................................................................................... 4
2.1 Affiniteit ...................................................................................................... 4
2.2 Aviditeit ....................................................................................................... 5
Hoofdstuk 2: Aantonen van antistoffen ...................................................................... 6
1. Precipitatie ....................................................................................................... 7
1.1 Algemeen principe ....................................................................................... 7
1.2 Precipitatiereacties in gel in afwezigheid van elektroforese ............................. 8
1.3 Precipitatiereacties in gel in aanwezigheid van elektroforese ......................... 10
2. Agglutinatie..................................................................................................... 11
2.1 Algemeen principe ..................................................................................... 11
2.2 Ringagglutinatie: ringtest ............................................................................ 13
2.3 Snelle agglutinatie of draagglas-agglutinatie ................................................ 14
2.4 Trage agglutinatie of buisjes-agglutinatie ..................................................... 15
2.5 Coombs’ test ............................................................................................. 16
2.6 Hemagglutinatie-inhibitie (HI) ..................................................................... 17
3. Neutralisatietest ............................................................................................. 19
4. Complementbindingsreactie ............................................................................ 20
4.1 Complement systeem ................................................................................ 20
4.2 Complementbindingstest ........................................................................... 20
5. Ligandbindingstesten ...................................................................................... 21
5.1 Enzym-immunoassays ............................................................................... 21
5.2 Immunoblotting of Western blotting ............................................................ 29
5.3 Fluorescentie-immunoassay (FIA) ............................................................... 31
Hoofdstuk 3: Evaluatie van aantal en functies van immuuncellen .............................. 33
1. Isolatie van leukocyten (- populaties of subpopulaties) uit bloed of weefsels ....... 33
1
, 1.1 Isolatie op basis van celdensiteit ............................................................... 33
1.2 Isolatie op basis van cellading .................................................................... 35
1.3 Isolatie op basis van fagocyterende eigenschappen ................................... 36
1.4 Isolatie op basis van adhesie ...................................................................... 36
1.5 Isolatie op basis van membraanmerkers .................................................... 36
2. Detectie van immuuncellen ............................................................................. 43
3. Functietesten .................................................................................................. 43
3.1 Functietesten voor lymfocyten ................................................................... 44
3.2 Functietesten voor lymfocyten, monocyten/macrofagen en granulocyten . 47
3.3 Functietesten voor monocyten / macrofagen en granulocyten ................... 52
Hoofdstuk 1: Eigenschappen van antistoffen
1. De antigeen-antistofbinding
1.1 Antigeen
• “vreemd partikel”
• In staat afweerreactie op te wekken
• ≠ epitoop: deel van een macromolecule (antigen) dat herkend kan worden door
antilichamen, B-cellen en T-cellen
• Gebonden door As
• Monovalent <> multivalent Ag
• Monoklonaal <> polyklonaal As
o Monoklonaal = verzameling van As gericht tegen 1 epitoop van hetzelfde
Ag
o Polyklonaal (antiserum) = verzameling van As gericht tegen veschillende
epitopen van hetzelfde Ag
• Kenmerken
o Grootte ↑
o Complexiteit ↑
o Structurele stabiliteit ↑ Immunogeniciteit ↑
o Afbreekbaarheid ↑
o Lichaamsvreemd ↑
2
,1.2 Antistof
• = immunoglobuline
• 2 zware ketens (α, δ, ε, γ, µ)
• Constant en variabel gedeelte
• Antigeenbindingsplaats
• Scharniergebied
• Disulfide bruggen
1.3 Antistof – antigeen interactie
• Basis van de immunochemie
• Dmv zwakke niet-covalente krachten
o Worden belangrijk wanneer Ag en As elkaar dicht benaderen
o Primaire binding Ag-As: zeer snel
o Secundaire binding Ag-As: trager
Primaire binding
• Van der Waals-krachten
o Aantrekkingskracht tussen oscillerende dipolen (afwisselend + en -) in
atomen
o Werkzaam tot afstand 1000 Å
o OE met de 7de macht van de afstand tussen moleculen
o Zwakker dan Coulombse krachten
• Coulombse krachten
o Elektrostatische krachten
o Tegengesteld geladen ionengroepen trekken elkaar aan
o Werkzaam tot afstand 100 Å
o OE met de 2de macht van de afstand tussen moleculen
o Belangrijk in het begin van de binding tussen Ag-As
Secundaire binding
• Waterstofbruggen
o Zwakke & omkeerbare interacties tussen hydrofiele groepen (-OH, -NH2 en
-COOH)
o Minder vlug in een waterig milieu → water neemt deel aan vorming van
waterstofbruggen
o Werkzaam over zeer korte afstand (1-1,5 Å)
o Geringe bijdrage in stabiliteit Ag-As binding
• Apolaire of hydrofobe krachten
o Interacties tussen apolaire groepen
o Werkzaam over korte afstand
o Belangrijk voor de vorming van Ag-As complexen
➔ water wordt uitgedreven
3
, Kost minder energie om Ag-As binding te verhinderen tijdens het proces dan om een
bestaande binding te verbreken
Hoe langer de binding kan plaatsgrijpen, hoe sterker de binding
Evenwichtsreactie
• Ka = reactieconstante bij associatie → snel
• Kd = reactieconstante bij dissociatie → wisselend verloop
2. Affiniteit en aviditeit
2.1 Affiniteit
Definitie
• Vermogen van 1 antistofmolecule om aan 1 epitoop te binden
• = som van alle non-covalente bindingen
Affiniteitsconstante
• Evenwichtsconstante: Ka
• Maat voor affiniteit van een As voor 1 epitoop van een Ag
• Hoge affiniteitsconstante: weinig Ag nodig om 50% van de bindingsplaatsen van
de As te verzadigen
• Zegt niet over de snelheid waarmee de binding gebeurt
• Wordt beïnvloed door:
o Afstand (Å)
o Krachten
o Factoren
▪ pH
• optimaal: 6,5-7
• mAs zijn gevoelig aan pH veranderingen
• pH veranderingen hebben sterke impact op Coulombse
krachten
▪ Ionensterkte
• Zoutconcentratie ↓ → Ka ↑
• Zoutconcentratie ↑
o → Ka ↓ indien binding vooral uit Coulombse krachten
bestaat
o → Ka ↑ indien binding vooral uit hydrofobe bindingen
bestaat
4
