Moleculaire biologie:
volledige samenvatting
Werkzitting
- Hoe studeren?
o Begrijpen
o Definiteis & begrippen (vermeld als eukaryoot of prokaryoot als versch definities,
o Schema’s en tekeningen wel, structueren niet kennen (tot he point!)
- Deel FC 10, Lint 10
- Deel FC
o 6 definities: in 3 regels, 2 zinnen max
o 1 open vraag te beantwoorden op 1 pagina
o 1 open vraag zonder pagina limiet
Hoofdstuk 1: DNA (p4 – 29)
Inleiding
Biochemische definities van levenZ
- Voor definitie van ‘leven’ moet je gebruik maken van combinatie verschillende voorwaarden:
o afgescheiden van leefomgeving door celmembraan/ celwand, inhoud (vooral H, O, C, N)
verschillend van omgeving.
o Energieopname en energieverbruik: noodzakelijk voor instandhouding van organisme en voor de
voortplanting.
o Groei: evolutie en complexiteit van organisme
o Voortplanting
o Beweging
o Interpretatie van prikkels: gegevens uit omgeving verzamelen en reageren op bepaalde condities
o Reageren/ communiceren: tussen soortgenoten maar ook tussen verschillende levensvormen
(communiceren met omgeving)
Waaruit bestaat een levende cel?
- De cel is de basisstructuur van levende organismen.
- De cel is een eenheid die afgescheiden is van zijn omgeving & bestaat uit een zeer georganiseerde
opbouw die tot stand komt door wisselwerking tussen proteïnen, lipiden, carbohydraten
(koolwaterstoffen) en nucleïnezuren.
- Er bestaan twee basistypen van cellen:
o prokaryoten = heeft wel nucleoid, membranen, cytoplasma maar GEEN celkern
o Eukaryote cellen = heeft verschillende compartimenten opgedeeld door membranen: celkern, …
,Historie erfelijkheidsleer
Eigenschappen zijn erfelijk: de genen
- Genen zijn informatie bevattende elementen voor:
o karakteristieken van individu
o de soort waartoe dit individu behoort coderen voor erfelijke eigenschappen.
- Genen werden voor het eerst gedefinieerd in studies van Mendel.
o lange erwten werden met korte erwten gekruist
o deze gaven in de eerste generatie uitsluitend lange erwten pas in de tweede
kwamen terug korte voor.
o Mendel kwam tot volgende wetmatigheden:
Waarneembare eigenschappen zijn terug te brengen tot overerfbare eenheden.
Elke diploïde cel bevat 2 gekoppelde genen, waarbij eventueel meerdere allelen
mogelijk zijn (elke variant van het gen).
Genen zijn óf dominant versus recessief (homozygoot) óf intermediair (heterozygoot).
Link tussen genen en biochemische processen door Garrod
- Garrod legde link tussen genen en biochemische processen via zeldzame aandoening alkaptonurie.
o Het heeft uiteenlopende symptomen maar bij baby’s met deze afwijking kleurt de urine, na
enige tijd blootgesteld aan lucht, zwart.
o Hij was 1ste die zei dat het door een defect gen kwam
- Hij beschreef alkaptonurie als een erfelijke veroorzaakte stofwisselingsziekte waarbij één defect gen
één defect enzym oplevert omdat de urine een hogere concentratie homogentisinezuur normaal
gezien afgebroken door dat enzym
Welk stoffen bevatten de genetische informatie?
Experimenteel onderzoeken
- Door waarnemingen besloten dat de chromosomen zijn die de dragers zijn van de genetische info.
o Chromosomen = draadvormige structuren die bestaan uit DNA en die drager zijn van de genen
- Duidelijke karakteristieken van een goed experiment:
o Duidelijke testbare hypothese
o Reproduceerbaar
o Positieve & negatieve controles
Om te onderzoeken welke stoffen de genetische info dragen componenten van de weefsels of cellen
gaan scheiden:
1. Homogeniseren van cellen = detergent of mechanisch breken (mixer of ultrasoon geluid)
2. Filteren = grote brokstukken te verwijderen.
3. De oplossing verdeling in fracties:
o Differentiële ultracentrifugatie = homogenaat wordt lage rotatie-snelheid
gecentrifugeerd, middelpuntvliedende kracht wordt groter dan de
zwaartekracht.
, De zwaarste celorganellen bevinden zich op debodem = ‘pellet’
resterende oplossing = ‘supernatans’.
Het pellet kan worden gescheiden van het supernatans en het supernatans kan opnieuw gescheiden
worden door een hoger toerental nodig van 50.000 rpm.
o Densiteitscentrifugatie = in centrifugebuis worden
verschillende lagen met stijgende sucrose-concentratie
aangebracht
Voorkomen vorming homogeen mengsel ontstaan
door densiteitsverschillen, onderaan hoogste conc
Hierboven komt celhomogenaat gecentrifugeerd
de organellen migreren richting bodem totdat ze op een laag zijn met gelijke dichtheid als
ze De opwaartse druk is hier gelijk aan neerwaartse, wat scheiding oplevert.
Op het einde zweeft elke organel dus op zijn eigen / gelijke laag
o De scheiding kan ook met CsCl (cesiumchloride) bij hoge rotatiesnelheden te centrifugeren
zakt naar bodem & ontstaat conc gradient.
Experiment van Griffith
- In experiment van Griffith werd gebruik gemaakt van S-stam (glad) en R-stam (onregelmatig) van
bacterie streptococcus pneumoniae, S-stam veroorzaakt een longontsteking.
- De volgende homogenaten werden ingespoten bij muis:
o De S-stam injecteren → longontsteking
o De R-stam injecteren → geen longontsteking
o Verhitte S-stam injecteren → geen longontsteking
o Een gehomogeniseerde S-stam + de R-stam → longontsteking: de
R-stam nam het dodelijke deel van de S-stam over
- Griffith besloot S-homogenaat te scheiden in RNA, eiwitten, DNA, vetten en koolwaterstoffen alle 5
groepen werd R-stam toegevoegd en ingespoten bij de muis alleen de muizen met DNA
ontwikkelde longontsteking
o BESLUIT: Met dit experiment werd voor de eerste maal aangetoond dat DNA de erfelijke
informatie (of genen) bevat.
Experiment Hershey-Chase: “worden de overerfbare eigenschappen via eiwitten of DNA van bacteriofaag
doorgegeven?”
- Bacteriofagen zijn virussen van bacteriën, deze parasiteren op de bacterie en gaan hem
herprogrammeren tot maken van bacteriofaag DNA, eiwitten, … barst later open en ontstaan
nieuwe bacteriofagen.
- We maken 2 proefbuizen door:
o E.coli en bacteriofagen samen te mengen en 5 min de tijd geven voor herprogrammeren
, o Daarna schudden & centrifugeren proefbuis met pellet (bacterien) en supernataraat
(bacteriofagen)
- Men bezat 2 culturen E. Coli die beiden werden besmet met bacteriofagen.
o E. coli + fagen + zwavel-35 (kan enkel inbouwen in eiwitten):
o E. coli + fagen + fosfor-32 (kan enkel inbouwen in DNA)
- Na schudden & centrifugeren zodat de bacteriën / e.coli zakken naar het pellet kunnen we de
resultaten bekijken:
o De pellet met E.coli besmet met bF + radioactief DNA radioactief
o Pellet met e.coli besmet met bF + radioactieve eiwitten niet radioactief
BESLUIT: Het DNA (radioactief fosfaat) bevat de erfelijke informatie over de bouwstenen (zowel DNA als eiwitten)
van de bacteriofagen
- Dus het is het DNA dat ervoor zorgde dat de e.coli geherprogrammeerd werd, en niet de eiwitten van de
bacteriofaag
De structuur van DNA
Deoxyribonucleïnezuur
- DNA of deoxyribonucleïnezuur bestaat uit lange polymeren (1m DNA per menselijke cel) die zijn opgebouwd uit:
o Deoxyribose (suiker): aan elkaar verbonden via fosfodiesterverbindingen: 5’-C via een fosfaatgroep met 3’-
C van vorige.
o Fosfaatgroepen: ribose en fosfaat wisselen elkaar af, de fosfaatgroepen zijn gekoppeld aan het 5’ uiteinde
van het deoxyribose.
o De 4 verschillende basen: adenine (A), guanine (G), cytosine (C) en thymine (T).
Purines: adenine en guanine; stikstof bevattende ringstructuur
Pyrimidines: thymine en cytosine; stikstof bevattende ringstructuur
Nucleoside = base verbonden aan deoxyribose via N-glycosidische binding
adenosine, cytidine, thymidine, guanosine, uridine.
o De nucleosiden zijn beter oplosbaar in water in vergelijking met de basen.
Nucleotide = fosfaatgroep verbonden aan 5’-C van nucleoside.
o Deze komt meestal vrij voor in de cel. De synthese van nucleotiden is mogelijk via 3
manieren:
via opbouwen
partiële hydrolyse van nucleïnezuren door nucleasen
afbraak van vrijgekomen basen, ze kunnen door enzymatisch
recuperatieproces omgezet worden tot nucleotiden.
o Er kunnen tot 3 fosfaatgroepen aan het 5’ C-atoom hangen via fosfo-anhydribide bindingen =
deoxyribonucleoside-tri-fosfaten
Fosfaat-groepen aangeduid met α, β en γ, startend vanaf suikerring
β en γ fosfaatgroepen kunnen worden afgesplitst door enzymen zonder andere bindingen te
verbreken = NTP’s
NTP’s zijn de belangrijkste overdragers van biochemische energie
, - Aan de 3’ C atoom komen de nucleobasen, tot vorming van dCMP, dTMP, dGMP en dAMP fosfaat groep
toegevoegd krijg je met Cytisine bv: deoxycytidinedifosfaat of bij 3 fosfaat groepen = deoxycitidinetrifosfaat
Andere belangrijke basen en nucleotiden
ATP: deoxyadenosine en/of adenosinetrifosfaat, NTPs zijn belangrijkste overdragers
van biochemische energie.
o Niet hetzelfde als dATP GEEN energiedrager, maar om DNA te maken
o ATP dient als RNA bouwer & energie drager
o Adenylaatcylase = verbindt 3’C uiteinde met alfa fosfaat
cAMP (cyclisch adenosine monofosfaat):
- Signaalmolecule gesynthetiseerd door adenylaatcyclase (α-fosfaat ATP
wordt verbonden met 3’OH ribose)
- concentratie aan cAMP wordt bepaald door de enzymen die het aanmaken
afbreken.
o Vb: afgebroken door het enzyme fosfodiësterase AMP door hydrolyse
van verbinding tussen fosfaat en 3’OH ribose
Cafeïne:
- inhibitor fosfodiësterase (omzetting van cAMP naar AMP)
- hierdoor stijgt concentratie en werking van cAMP en dit houdt het organisme in
geëxciteerde toestand
AZT (3’-azido-2’-deoxythymidine)
- AIDS-remmer inhibeert het enzyme reverse-transcriptase van HIV-virus
waardoor er minder nieuwe virussen worden gevormd.
- 3 stikstoffen / N = azido groep
Nu wordt tenofovir gebruikt voor AIDS-remming
,Extra’s:
- Co-enzym A: betrokken bij acyltransferreacties.
- NAD (nicotinamide adenine dinucleotide): betrokken met
elektrontransferreacties.
- FAD (flavin adenine dinucleotide): betrokken met
elektrontransferreacties.
- SAM (S-adenosylmethionine): dit is de methyldonor in
verschillende methyleringen van basen en eiwitten
Viagra:
- Inhibitor van een cyclis nucleotide pohsphodiesterase (PDE-
5)
- Voorkomt dat cGMP in GMP wordt gevormd
o cGMP = stijging bloeddruk
o GMP = daling bloeddruk viagra voorkomt vorming
Eigenschappen van DNA
Het model van de β-helix
- Regels van Chargaff: DNA-basen komen in gelijke verhouding voor: A is stoichiometrisch gelijk aan T en C aan G.
- Rosalind Franklin: bepaling van structuur van DNA door X-straaldiffracties op gekristalliseerd DNA te
bestuderen.
o Toonde dat DNA helicaal is
- Watson en Crick: nieuwe model DNA
o DNA is dubbelstrengig vormen een helix & zijn antiparallel (= de 5’ en 3’ richtingen zijn parallel maar wijzen in
tov richting)
o basen gekoppeld zijn (A-T, C-G) via H-bruggen = complementair
o gelijke afstand tussen de ruggengraten = stabiliteit
- Dubbele DNA helix heeft 10,4 basenparen per winding (360°)
- Er zijn meerdere DNA vormen:
o B-vorm = ribosen en P-groepen zijn naar buiten gericht (backbone), basenparen naar binnen. Heeft een grote &
kleine groeve doordat de N-glycosidische bindingen versch liggen
o Z-DNA: een andere helix-vorm.
, o Tripel-helix: hierin zitten 3 strengen verwikkeld.
Stabiliteit van DNA
- Grote aantallen van H-bruggen
- Opeenvolgende basenparen ondervinden van Der Waals krachten stapeling zorgt voor stabiliteit
- Stabiliteit kan gebroken worden door denaturatie (= hoge temp
Hoe wordt een basenvolgorde in DNA genoteerd
- We hebben altijd maar één sequentie nodig, omdat de andere complementair anti-parallel verloopt. Noteren ook
alleen de nucleobasen
o coding streng 5’ → 3’: indien er een streng gegeven wordt, is het meestal deze. (als de 5’ of 3’ niet gegeven
wordt)
o Anti-coding streng 3’ → 5’: hiervan wordt mRNA afgelezen
Wat is een palindromische sequentie?
- palindroomsequenties = sequenties waarvan beide helices in gelijke richting dezelfde sequentie hebben.
o Dus de onderste complementaire streng moet worden omgedraaid (vb. 5’-TCCGATCGGA-3’ → 3’-
AGGCTAGCCT-5’).
- Worden herkend door restrictie-enzymen = endonucleasen die DNA-ruggengraat specifiek kunnen knippen.
o Dit betekent dat grote DNA- fragmenten (chromosomen) kunnen worden verdeeld in kleinere fragmenten
m.b.v. deze enzymen.
Hyperchromiciteit en hybridisatie
- Dubbelstrengig DNA neemt minder licht op dan enkelstrengig DNA
- Dus als we de absorptie van DNA in functie zetten met temperatuur hebben een maximale waarde (de
smelttemperatuur) van DNA.
- Als je de temperatuur omhoog doet gaat DNA denatureren en plots enkelstrengig worden = hyperchromaciteit
o Dan neemt de lichtabsorptie ineens kei snel toe
- Als je DNA eerst denatureert en dan laat afkoelen, zullen de 2 strengen elkaar terug vinden omwille van hun
complementariteit hybridiseren tot een dubbelstreng.
o Op voorwaarde dat het DNA mengsel niet te complex is en de temperatuurdaling traag gebeurt.
DNA-elektroforese
- DNA-elektroforese wordt gebruikt voor
, o DNA bekijken
o DNA-moleculen van verschillende lengten scheiden
o bepaalde DNA-fragmenten zuiveren.
- Werking:
o Hierbij wordt gebruik gemaakt van een agarose-gel = zeewierextract, een niet-ionisch, sterk hydrofiel en
gellerend polysacharide, pas gel-vormend na afkoeling
o Deze gel wordt aangebracht in een bak, waarop een elektrisch veld is aangelegd.
o Er worden gaten gemaakt met een kam waar we stukjes DNA in kunnen doen.
o Doordat fosfaatgroepen vd DNA ruggengraat negatief zijn gaat door de gel migreren naar de positieve
pool.
o Scheiding vindt nu plaats op basis van lengte omdat de grotere/langere fragmenten zich moeilijker door de
netwerken van de gel kunnen wringen.
- Nu scheiding heeft plaatsgevonden, moet het nog zichtbaar worden gemaakt.
o Hiervoor werd EthidiumBromide (EtBr) gebruikt, het zal zich tussen
basenparen in dubbelstrengig DNA zetten.
o Het fluoresceert wanneer het belicht wordt met UV licht, na belichting
weet je waar DNA zich bevindt.
Nu gebruikt men SYBR-Safe aangezien EtBr kankerverwekkend is.
o Door een vergelijking te maken met DNA-fragmenten van gekende lengte
(= een marker), kan men de lengte van een DNA fragment extrapoleren.
Hoofdstuk 2: DNA-replicatie (p30 – 47)
Inleiding
DNA kan zeer lang zijn en wordt dus sterk opgerold om in de kern te passen. Het kopiëren moet snel en correct
gebeuren waarna DNA wordt ontwonden en weer wordt opgerold tot het tot expressie komen van kenmerken. Bij
voortplanting worden kenmerken en hun informatie doorgegeven aan de nakomelingen. Menselijke cellen kunnen
volledig delen ongeveer om de 8 uren. Een cel moet dus een juiste kopie van haar DNA doorgeven aan haar twee
dochtercellen. Deze replicatie moet correct verlopen want het gevolg van 1 foutje op één miljoen basen is niet min, als
bevruchte eicel 6,6 miljard basenparen heeft en deze 1016 keer zal delen.
Replicatie is semi-conservatief
De mogelijke theorieën achter DNA-replicatie:
- Conservatieve replicatie (volledig behoudend):
o vorming van twee nieuwe complementaire strengen.
o Oorspronkelijke streng volledig behouden
- Dispersieve replicatie:
o in oude en nieuwe streng zitten stukjes van het oorspronkelijk DNA samen met dan nieuw aangemaakt
DNA
- Semi-conservatieve replicatie (half-behoudend):
volledige samenvatting
Werkzitting
- Hoe studeren?
o Begrijpen
o Definiteis & begrippen (vermeld als eukaryoot of prokaryoot als versch definities,
o Schema’s en tekeningen wel, structueren niet kennen (tot he point!)
- Deel FC 10, Lint 10
- Deel FC
o 6 definities: in 3 regels, 2 zinnen max
o 1 open vraag te beantwoorden op 1 pagina
o 1 open vraag zonder pagina limiet
Hoofdstuk 1: DNA (p4 – 29)
Inleiding
Biochemische definities van levenZ
- Voor definitie van ‘leven’ moet je gebruik maken van combinatie verschillende voorwaarden:
o afgescheiden van leefomgeving door celmembraan/ celwand, inhoud (vooral H, O, C, N)
verschillend van omgeving.
o Energieopname en energieverbruik: noodzakelijk voor instandhouding van organisme en voor de
voortplanting.
o Groei: evolutie en complexiteit van organisme
o Voortplanting
o Beweging
o Interpretatie van prikkels: gegevens uit omgeving verzamelen en reageren op bepaalde condities
o Reageren/ communiceren: tussen soortgenoten maar ook tussen verschillende levensvormen
(communiceren met omgeving)
Waaruit bestaat een levende cel?
- De cel is de basisstructuur van levende organismen.
- De cel is een eenheid die afgescheiden is van zijn omgeving & bestaat uit een zeer georganiseerde
opbouw die tot stand komt door wisselwerking tussen proteïnen, lipiden, carbohydraten
(koolwaterstoffen) en nucleïnezuren.
- Er bestaan twee basistypen van cellen:
o prokaryoten = heeft wel nucleoid, membranen, cytoplasma maar GEEN celkern
o Eukaryote cellen = heeft verschillende compartimenten opgedeeld door membranen: celkern, …
,Historie erfelijkheidsleer
Eigenschappen zijn erfelijk: de genen
- Genen zijn informatie bevattende elementen voor:
o karakteristieken van individu
o de soort waartoe dit individu behoort coderen voor erfelijke eigenschappen.
- Genen werden voor het eerst gedefinieerd in studies van Mendel.
o lange erwten werden met korte erwten gekruist
o deze gaven in de eerste generatie uitsluitend lange erwten pas in de tweede
kwamen terug korte voor.
o Mendel kwam tot volgende wetmatigheden:
Waarneembare eigenschappen zijn terug te brengen tot overerfbare eenheden.
Elke diploïde cel bevat 2 gekoppelde genen, waarbij eventueel meerdere allelen
mogelijk zijn (elke variant van het gen).
Genen zijn óf dominant versus recessief (homozygoot) óf intermediair (heterozygoot).
Link tussen genen en biochemische processen door Garrod
- Garrod legde link tussen genen en biochemische processen via zeldzame aandoening alkaptonurie.
o Het heeft uiteenlopende symptomen maar bij baby’s met deze afwijking kleurt de urine, na
enige tijd blootgesteld aan lucht, zwart.
o Hij was 1ste die zei dat het door een defect gen kwam
- Hij beschreef alkaptonurie als een erfelijke veroorzaakte stofwisselingsziekte waarbij één defect gen
één defect enzym oplevert omdat de urine een hogere concentratie homogentisinezuur normaal
gezien afgebroken door dat enzym
Welk stoffen bevatten de genetische informatie?
Experimenteel onderzoeken
- Door waarnemingen besloten dat de chromosomen zijn die de dragers zijn van de genetische info.
o Chromosomen = draadvormige structuren die bestaan uit DNA en die drager zijn van de genen
- Duidelijke karakteristieken van een goed experiment:
o Duidelijke testbare hypothese
o Reproduceerbaar
o Positieve & negatieve controles
Om te onderzoeken welke stoffen de genetische info dragen componenten van de weefsels of cellen
gaan scheiden:
1. Homogeniseren van cellen = detergent of mechanisch breken (mixer of ultrasoon geluid)
2. Filteren = grote brokstukken te verwijderen.
3. De oplossing verdeling in fracties:
o Differentiële ultracentrifugatie = homogenaat wordt lage rotatie-snelheid
gecentrifugeerd, middelpuntvliedende kracht wordt groter dan de
zwaartekracht.
, De zwaarste celorganellen bevinden zich op debodem = ‘pellet’
resterende oplossing = ‘supernatans’.
Het pellet kan worden gescheiden van het supernatans en het supernatans kan opnieuw gescheiden
worden door een hoger toerental nodig van 50.000 rpm.
o Densiteitscentrifugatie = in centrifugebuis worden
verschillende lagen met stijgende sucrose-concentratie
aangebracht
Voorkomen vorming homogeen mengsel ontstaan
door densiteitsverschillen, onderaan hoogste conc
Hierboven komt celhomogenaat gecentrifugeerd
de organellen migreren richting bodem totdat ze op een laag zijn met gelijke dichtheid als
ze De opwaartse druk is hier gelijk aan neerwaartse, wat scheiding oplevert.
Op het einde zweeft elke organel dus op zijn eigen / gelijke laag
o De scheiding kan ook met CsCl (cesiumchloride) bij hoge rotatiesnelheden te centrifugeren
zakt naar bodem & ontstaat conc gradient.
Experiment van Griffith
- In experiment van Griffith werd gebruik gemaakt van S-stam (glad) en R-stam (onregelmatig) van
bacterie streptococcus pneumoniae, S-stam veroorzaakt een longontsteking.
- De volgende homogenaten werden ingespoten bij muis:
o De S-stam injecteren → longontsteking
o De R-stam injecteren → geen longontsteking
o Verhitte S-stam injecteren → geen longontsteking
o Een gehomogeniseerde S-stam + de R-stam → longontsteking: de
R-stam nam het dodelijke deel van de S-stam over
- Griffith besloot S-homogenaat te scheiden in RNA, eiwitten, DNA, vetten en koolwaterstoffen alle 5
groepen werd R-stam toegevoegd en ingespoten bij de muis alleen de muizen met DNA
ontwikkelde longontsteking
o BESLUIT: Met dit experiment werd voor de eerste maal aangetoond dat DNA de erfelijke
informatie (of genen) bevat.
Experiment Hershey-Chase: “worden de overerfbare eigenschappen via eiwitten of DNA van bacteriofaag
doorgegeven?”
- Bacteriofagen zijn virussen van bacteriën, deze parasiteren op de bacterie en gaan hem
herprogrammeren tot maken van bacteriofaag DNA, eiwitten, … barst later open en ontstaan
nieuwe bacteriofagen.
- We maken 2 proefbuizen door:
o E.coli en bacteriofagen samen te mengen en 5 min de tijd geven voor herprogrammeren
, o Daarna schudden & centrifugeren proefbuis met pellet (bacterien) en supernataraat
(bacteriofagen)
- Men bezat 2 culturen E. Coli die beiden werden besmet met bacteriofagen.
o E. coli + fagen + zwavel-35 (kan enkel inbouwen in eiwitten):
o E. coli + fagen + fosfor-32 (kan enkel inbouwen in DNA)
- Na schudden & centrifugeren zodat de bacteriën / e.coli zakken naar het pellet kunnen we de
resultaten bekijken:
o De pellet met E.coli besmet met bF + radioactief DNA radioactief
o Pellet met e.coli besmet met bF + radioactieve eiwitten niet radioactief
BESLUIT: Het DNA (radioactief fosfaat) bevat de erfelijke informatie over de bouwstenen (zowel DNA als eiwitten)
van de bacteriofagen
- Dus het is het DNA dat ervoor zorgde dat de e.coli geherprogrammeerd werd, en niet de eiwitten van de
bacteriofaag
De structuur van DNA
Deoxyribonucleïnezuur
- DNA of deoxyribonucleïnezuur bestaat uit lange polymeren (1m DNA per menselijke cel) die zijn opgebouwd uit:
o Deoxyribose (suiker): aan elkaar verbonden via fosfodiesterverbindingen: 5’-C via een fosfaatgroep met 3’-
C van vorige.
o Fosfaatgroepen: ribose en fosfaat wisselen elkaar af, de fosfaatgroepen zijn gekoppeld aan het 5’ uiteinde
van het deoxyribose.
o De 4 verschillende basen: adenine (A), guanine (G), cytosine (C) en thymine (T).
Purines: adenine en guanine; stikstof bevattende ringstructuur
Pyrimidines: thymine en cytosine; stikstof bevattende ringstructuur
Nucleoside = base verbonden aan deoxyribose via N-glycosidische binding
adenosine, cytidine, thymidine, guanosine, uridine.
o De nucleosiden zijn beter oplosbaar in water in vergelijking met de basen.
Nucleotide = fosfaatgroep verbonden aan 5’-C van nucleoside.
o Deze komt meestal vrij voor in de cel. De synthese van nucleotiden is mogelijk via 3
manieren:
via opbouwen
partiële hydrolyse van nucleïnezuren door nucleasen
afbraak van vrijgekomen basen, ze kunnen door enzymatisch
recuperatieproces omgezet worden tot nucleotiden.
o Er kunnen tot 3 fosfaatgroepen aan het 5’ C-atoom hangen via fosfo-anhydribide bindingen =
deoxyribonucleoside-tri-fosfaten
Fosfaat-groepen aangeduid met α, β en γ, startend vanaf suikerring
β en γ fosfaatgroepen kunnen worden afgesplitst door enzymen zonder andere bindingen te
verbreken = NTP’s
NTP’s zijn de belangrijkste overdragers van biochemische energie
, - Aan de 3’ C atoom komen de nucleobasen, tot vorming van dCMP, dTMP, dGMP en dAMP fosfaat groep
toegevoegd krijg je met Cytisine bv: deoxycytidinedifosfaat of bij 3 fosfaat groepen = deoxycitidinetrifosfaat
Andere belangrijke basen en nucleotiden
ATP: deoxyadenosine en/of adenosinetrifosfaat, NTPs zijn belangrijkste overdragers
van biochemische energie.
o Niet hetzelfde als dATP GEEN energiedrager, maar om DNA te maken
o ATP dient als RNA bouwer & energie drager
o Adenylaatcylase = verbindt 3’C uiteinde met alfa fosfaat
cAMP (cyclisch adenosine monofosfaat):
- Signaalmolecule gesynthetiseerd door adenylaatcyclase (α-fosfaat ATP
wordt verbonden met 3’OH ribose)
- concentratie aan cAMP wordt bepaald door de enzymen die het aanmaken
afbreken.
o Vb: afgebroken door het enzyme fosfodiësterase AMP door hydrolyse
van verbinding tussen fosfaat en 3’OH ribose
Cafeïne:
- inhibitor fosfodiësterase (omzetting van cAMP naar AMP)
- hierdoor stijgt concentratie en werking van cAMP en dit houdt het organisme in
geëxciteerde toestand
AZT (3’-azido-2’-deoxythymidine)
- AIDS-remmer inhibeert het enzyme reverse-transcriptase van HIV-virus
waardoor er minder nieuwe virussen worden gevormd.
- 3 stikstoffen / N = azido groep
Nu wordt tenofovir gebruikt voor AIDS-remming
,Extra’s:
- Co-enzym A: betrokken bij acyltransferreacties.
- NAD (nicotinamide adenine dinucleotide): betrokken met
elektrontransferreacties.
- FAD (flavin adenine dinucleotide): betrokken met
elektrontransferreacties.
- SAM (S-adenosylmethionine): dit is de methyldonor in
verschillende methyleringen van basen en eiwitten
Viagra:
- Inhibitor van een cyclis nucleotide pohsphodiesterase (PDE-
5)
- Voorkomt dat cGMP in GMP wordt gevormd
o cGMP = stijging bloeddruk
o GMP = daling bloeddruk viagra voorkomt vorming
Eigenschappen van DNA
Het model van de β-helix
- Regels van Chargaff: DNA-basen komen in gelijke verhouding voor: A is stoichiometrisch gelijk aan T en C aan G.
- Rosalind Franklin: bepaling van structuur van DNA door X-straaldiffracties op gekristalliseerd DNA te
bestuderen.
o Toonde dat DNA helicaal is
- Watson en Crick: nieuwe model DNA
o DNA is dubbelstrengig vormen een helix & zijn antiparallel (= de 5’ en 3’ richtingen zijn parallel maar wijzen in
tov richting)
o basen gekoppeld zijn (A-T, C-G) via H-bruggen = complementair
o gelijke afstand tussen de ruggengraten = stabiliteit
- Dubbele DNA helix heeft 10,4 basenparen per winding (360°)
- Er zijn meerdere DNA vormen:
o B-vorm = ribosen en P-groepen zijn naar buiten gericht (backbone), basenparen naar binnen. Heeft een grote &
kleine groeve doordat de N-glycosidische bindingen versch liggen
o Z-DNA: een andere helix-vorm.
, o Tripel-helix: hierin zitten 3 strengen verwikkeld.
Stabiliteit van DNA
- Grote aantallen van H-bruggen
- Opeenvolgende basenparen ondervinden van Der Waals krachten stapeling zorgt voor stabiliteit
- Stabiliteit kan gebroken worden door denaturatie (= hoge temp
Hoe wordt een basenvolgorde in DNA genoteerd
- We hebben altijd maar één sequentie nodig, omdat de andere complementair anti-parallel verloopt. Noteren ook
alleen de nucleobasen
o coding streng 5’ → 3’: indien er een streng gegeven wordt, is het meestal deze. (als de 5’ of 3’ niet gegeven
wordt)
o Anti-coding streng 3’ → 5’: hiervan wordt mRNA afgelezen
Wat is een palindromische sequentie?
- palindroomsequenties = sequenties waarvan beide helices in gelijke richting dezelfde sequentie hebben.
o Dus de onderste complementaire streng moet worden omgedraaid (vb. 5’-TCCGATCGGA-3’ → 3’-
AGGCTAGCCT-5’).
- Worden herkend door restrictie-enzymen = endonucleasen die DNA-ruggengraat specifiek kunnen knippen.
o Dit betekent dat grote DNA- fragmenten (chromosomen) kunnen worden verdeeld in kleinere fragmenten
m.b.v. deze enzymen.
Hyperchromiciteit en hybridisatie
- Dubbelstrengig DNA neemt minder licht op dan enkelstrengig DNA
- Dus als we de absorptie van DNA in functie zetten met temperatuur hebben een maximale waarde (de
smelttemperatuur) van DNA.
- Als je de temperatuur omhoog doet gaat DNA denatureren en plots enkelstrengig worden = hyperchromaciteit
o Dan neemt de lichtabsorptie ineens kei snel toe
- Als je DNA eerst denatureert en dan laat afkoelen, zullen de 2 strengen elkaar terug vinden omwille van hun
complementariteit hybridiseren tot een dubbelstreng.
o Op voorwaarde dat het DNA mengsel niet te complex is en de temperatuurdaling traag gebeurt.
DNA-elektroforese
- DNA-elektroforese wordt gebruikt voor
, o DNA bekijken
o DNA-moleculen van verschillende lengten scheiden
o bepaalde DNA-fragmenten zuiveren.
- Werking:
o Hierbij wordt gebruik gemaakt van een agarose-gel = zeewierextract, een niet-ionisch, sterk hydrofiel en
gellerend polysacharide, pas gel-vormend na afkoeling
o Deze gel wordt aangebracht in een bak, waarop een elektrisch veld is aangelegd.
o Er worden gaten gemaakt met een kam waar we stukjes DNA in kunnen doen.
o Doordat fosfaatgroepen vd DNA ruggengraat negatief zijn gaat door de gel migreren naar de positieve
pool.
o Scheiding vindt nu plaats op basis van lengte omdat de grotere/langere fragmenten zich moeilijker door de
netwerken van de gel kunnen wringen.
- Nu scheiding heeft plaatsgevonden, moet het nog zichtbaar worden gemaakt.
o Hiervoor werd EthidiumBromide (EtBr) gebruikt, het zal zich tussen
basenparen in dubbelstrengig DNA zetten.
o Het fluoresceert wanneer het belicht wordt met UV licht, na belichting
weet je waar DNA zich bevindt.
Nu gebruikt men SYBR-Safe aangezien EtBr kankerverwekkend is.
o Door een vergelijking te maken met DNA-fragmenten van gekende lengte
(= een marker), kan men de lengte van een DNA fragment extrapoleren.
Hoofdstuk 2: DNA-replicatie (p30 – 47)
Inleiding
DNA kan zeer lang zijn en wordt dus sterk opgerold om in de kern te passen. Het kopiëren moet snel en correct
gebeuren waarna DNA wordt ontwonden en weer wordt opgerold tot het tot expressie komen van kenmerken. Bij
voortplanting worden kenmerken en hun informatie doorgegeven aan de nakomelingen. Menselijke cellen kunnen
volledig delen ongeveer om de 8 uren. Een cel moet dus een juiste kopie van haar DNA doorgeven aan haar twee
dochtercellen. Deze replicatie moet correct verlopen want het gevolg van 1 foutje op één miljoen basen is niet min, als
bevruchte eicel 6,6 miljard basenparen heeft en deze 1016 keer zal delen.
Replicatie is semi-conservatief
De mogelijke theorieën achter DNA-replicatie:
- Conservatieve replicatie (volledig behoudend):
o vorming van twee nieuwe complementaire strengen.
o Oorspronkelijke streng volledig behouden
- Dispersieve replicatie:
o in oude en nieuwe streng zitten stukjes van het oorspronkelijk DNA samen met dan nieuw aangemaakt
DNA
- Semi-conservatieve replicatie (half-behoudend):
