De twee verschillen vooral door de bron die gebruikt wordt en daardoor ook hun resolutie. Bij
lichtmicroscopie wordt zichtbaar licht gebruikt en glaslenzen, het wordt gebruikt voor het onderzoeken van
weefsels of cellen van grootte +- 0,5cm tot 100nm (grootte tot een bacterie), je kunt er dus vooral cellen,
celstructuren en andere histologisce structuren mee bekijken. Bij elektronenmicroscopie gebruik je een
elektronenwolk ipv licht waardoor de resolutie veel hoger is. Hierdoor kun je fijnere intracellulaire details
zien bij cellen/weefsles van +- 10 microm tot 0,1nm (grootte van een bloedcel tot een atoom).
De technieken om de weefsels te prepareren zijn:
• Invriezen in vloeibaar N2, het is snel en dna/rna en eiwitten blijven goed bewaard, maar kwaliteit is niet top.
• Fixeren, dan water onttrekken ( om rottingsproces tegen te gaan, dehydrateren) en solateren. Daarna wordt
het in een kubusje pareffine (kaarsvet) gestoken voor LM of in epoxyhars voor EM.
◦bij het fixeren voor LM wordt formol gebruikt
◦Bij het fixeren voor EM wordt glutaraldehyde gebruikt, wordt nog steviger omdat steeds meer bindingen w
gevormd.
=> Daarna wordt het in flinterdunne schijfjes gesneden (ong 3-10 microm) voor onder de lichtmicroscoop,
(kleiner dan 1 microm) voor EM.
,Door het weefsel onder te dompelen in de fixatievloeistof vormen er covalente bindingen met de N-terminale
groepen van eiwitten, dit is crosslinking. Door het fixeren verliezen de meeste enzymen hun werking.
Formaldehyde wordt gebruikt om preparaten te fixeren die bedoeld zijn voor onder de lichtmicroscoop.
Glutaaraldehyde gebruikt men om preparaten bedoeld voor de TEM te fixeren. De bedoeling van fixeren is het
steviger maken van het preparaat, het verschil tussen de twee fixatievloeistoffen ligt in hoe sterk en fijn ze
fixeren. Formaldehyde maakt minder bindingen (1C) en dringt sneller in het weefsel, ook bewaart het de
algemene weefselstructuur goed. Glutaaraldehyde dringt trager in het weefsel en maakt veel en sterke
bindingen (4C) tussen de eiwitten, hierdoor fixeert het steviger en nauwkeuriger waardoor de ultrastructuur
goed behouden wordt.
• Invriezen of fixeren:
• Invriezen is het snelst, in vloeibaar N2 bij -80°C, daarna gesneden met cryostaat, met HE kleuring bekijken
onder lichtmicroscoop
• Afname van het weefsel, tijdens de operatie neemt men een stukje weefsel uit een letsel of tumor. Na het
afnemen moet het staal zsm verwerkt worden om afbraak van cellen en eiwitten te voorkomen.
• Fixatie, bij lichtmicroscopie in formol/formaldehyde, bij EM glutaaraldehyde. Maar meestal gebruikt men
lichtmicroscopie dus formol. Deze stap doet men om afbraak tegen te gaan, de structuren van het weefsel te
bewaren en het staal steviger te maken voor verdere verwerking.
• Ontwateren, het weefsel wordt gedehydrateerd om te voorkomen dat het gaat rotten en omdat het hierna
inbed wordt in een medium dat niet mengt met water.
• Inbedden, voor lichtmicroscopie wordt het weefsel ingebed in paraffine, dat zorgt ervoor dat het stevig
genoeg wordt om later dunne schijfjes te kunnen maken. (Bij EM in epoxiehars)
• snijden, nu worden er dunne schijfjes/coupes gemaakt. Voor lichtmicroscopie zijn deze3-10 microm dik. Het
moet zo dun zijn zodat licht erdoorheen kan en het preparaat goed zichtbaar wordt onder de microscoop.
• Op draagglas plaatsen, zodat ze verder gekleurd en onderzocht kunnen worden.
• Kleuring, het preparaat wordt gekleurd dmv empirische kleuring (vooral H&E kleuring),
enzymgebaseerdekleuring of immunohistochemie.
• Onderzoek met lichtmicroscoop, er wordt gekeken naar de algemene weefselstructuur, de ligging en vorm
van de cellen, afwijkingen zoals ontstekingen of tumor en eventueel de aanwezigheid van specifieke eiwitten
via immunohistochemie.
• Diagnostische interpretatie, obv de microscopische bevindingen wordt een diagnose gesteld.
,Bij directe immunohistochemie is het primaire antilichaam zelf gelabeld met een enzym of kleur. Dat bindt dan
rechtstreeks aan het specifieke eiwit. Ze zouden dit gebruiken om dat het eenvoudig en snel is maar het is
duur en niet efficient omdat je voor elk eiwit opnieuw een gelabeld primair antilichaam moet maken.
Bij indirecte immunohistochemie gebruikt men eerst een ongelabeld primair AL dat aan het doelwit bindt,
daarna gebruikt men een gelabeld secundair AL dat bindt aan de primaire AL. Het secundaire AL is meestal
gericht tegen antilichamen van 1 bepaalde diersoort. Het wordt gebruikt omdat het goedkoper en praktischer is,
doordat meerdere primaire AL van dezelfde soort met hetzelfde secundaire AL gedetecteerd kunnen worden.
Het is ook handig om meerdere eiwitten tegelijk te onderzoekn door primaire AL uit verschillende diersoorten
te gebruiken, dan kan je verschillende secundaire AL gebruiken met verschillende labels.
Men gebruikt signaalamplificatie als de hoeveelheid doelwit-eiwit in het weefsel heel laag is.
Bv bij streptavidine, die heeft meerdere bindingsplaatsen en bindt sterk met biotine. Men gaat dus aan
secundair of primair AL biotine hangen. Zo krijg je een soort boomstructuur waar meerdere signaalmoleculen
of fluorescentiemerkers kunnen koppelen wat zorgt voor een duidelijkere detectie van eiwitten die in lage
concentratie aanwezig zijn.
Bij immunofluorescentie wordt de binding met het AL zichtbaar gemaakt met een fluorescente merker ipv met
een kleurreactie. Het werkt hetzelfde als immunohistochemie maar de detectie gebeurt via lichtemissie van een
fluorochroom. Men gebruikt dit omdat eiwitten gevoelig zijn voor detectie hiervan, het is geschikt om meerder
eiwitten tegelijk aan te tonen met verschillende kleuren en het geeft duidelijke lokalisering van eiwitten in
een cel of weefsel.
De verschillende methoden bestaan voor diagnotisch therapeutisch project (vb cytokinese), prognotisch doel en
therapeutische beslissing:
• Bij diagnostiek om bepaalde eiwitten te zoeken die de oorsprong van een tumor bepalen, vb CK20 komt voor
in gastro-intestinale systeem, CK8 in de lever, dus als men een CK20 in de lever aantreft weet men dat het
afkomstig is uit get gastro-intestinale stelsel.
• Bij prognose, als je bv een P16 eiwit vindt kan dat wijzen op een betere prognose, omdat dat de celcyclus
afremt.
• Bij therapeutische beslissing vindt men bv HER2 eiwit dat wijst op borstkanker, als die tot expressie komt kan
een Herceptin behandeling nuttig zijn, zonder HER2 zou die behandeling niet werken.
, • Empirische kleuring: dit gebeurt met de stoffen hematoxiline die een blauwe kleur geeft en eosine die een
rode kleur geeft. Dit is een techniek die is ontstaan door trial and error, het heeft te maken met de
elektrostatische aantrekking. Hematoxyline is een basische positief geladen kleurstof en eosine is een zure
negatief geladen kleurstof. De blauwe kleur bindt dus aan negatief geladen structuren en de rode kleur aan
positief geladen structuren.
• Enzym gebaseerde kleuring: kleurloos wordt omgezet naar kleur door enymatische activiteit. In het weefsel
zit een bepaald enzym, door het toevoegen van een (meestal kleurloos) substraat, gaat het enzym dat
substraat omzetten in een gekleurd product, dat slaat neer op de plek waar het enzym zit.
• Immunohistochemie, specifieke eiwitten in het weefsel worden zichtbaar gemaakt met antilichamen. Een
antilichaam bindt specifiek aan een bepaald eiwit in het weefsel. Dat antilichaam is gekoppeld aan een enzym
of fluorescentie, dat zorgt voor een kleurreactie of lichtsignaal. Je kan immunohistochemie onderscheiden in
directe, indirect en geamplificeerde immunohistochemie of fluorescentie.
◦directe: gelabeld primair AL bindt rechtstreeks aan antigeen, snel en eenvoudig, minder gevoelig en duur
◦Indirecte: primair AL en gelabeld secundair AL, sterk signaal en goedkoper, felxibeler
◦geamplificeerde immunohistochemie: extra signaalversterking, zeer gevoelig, geschikt bij weinig eiwit
◦Immunofluorescentie: antilichaam met fluorescente label, signaal zichtbaar onder
fluorescentiemicroscoop, meerdere eiwitten tegelijk mogelijk.
lichtmicroscopie wordt zichtbaar licht gebruikt en glaslenzen, het wordt gebruikt voor het onderzoeken van
weefsels of cellen van grootte +- 0,5cm tot 100nm (grootte tot een bacterie), je kunt er dus vooral cellen,
celstructuren en andere histologisce structuren mee bekijken. Bij elektronenmicroscopie gebruik je een
elektronenwolk ipv licht waardoor de resolutie veel hoger is. Hierdoor kun je fijnere intracellulaire details
zien bij cellen/weefsles van +- 10 microm tot 0,1nm (grootte van een bloedcel tot een atoom).
De technieken om de weefsels te prepareren zijn:
• Invriezen in vloeibaar N2, het is snel en dna/rna en eiwitten blijven goed bewaard, maar kwaliteit is niet top.
• Fixeren, dan water onttrekken ( om rottingsproces tegen te gaan, dehydrateren) en solateren. Daarna wordt
het in een kubusje pareffine (kaarsvet) gestoken voor LM of in epoxyhars voor EM.
◦bij het fixeren voor LM wordt formol gebruikt
◦Bij het fixeren voor EM wordt glutaraldehyde gebruikt, wordt nog steviger omdat steeds meer bindingen w
gevormd.
=> Daarna wordt het in flinterdunne schijfjes gesneden (ong 3-10 microm) voor onder de lichtmicroscoop,
(kleiner dan 1 microm) voor EM.
,Door het weefsel onder te dompelen in de fixatievloeistof vormen er covalente bindingen met de N-terminale
groepen van eiwitten, dit is crosslinking. Door het fixeren verliezen de meeste enzymen hun werking.
Formaldehyde wordt gebruikt om preparaten te fixeren die bedoeld zijn voor onder de lichtmicroscoop.
Glutaaraldehyde gebruikt men om preparaten bedoeld voor de TEM te fixeren. De bedoeling van fixeren is het
steviger maken van het preparaat, het verschil tussen de twee fixatievloeistoffen ligt in hoe sterk en fijn ze
fixeren. Formaldehyde maakt minder bindingen (1C) en dringt sneller in het weefsel, ook bewaart het de
algemene weefselstructuur goed. Glutaaraldehyde dringt trager in het weefsel en maakt veel en sterke
bindingen (4C) tussen de eiwitten, hierdoor fixeert het steviger en nauwkeuriger waardoor de ultrastructuur
goed behouden wordt.
• Invriezen of fixeren:
• Invriezen is het snelst, in vloeibaar N2 bij -80°C, daarna gesneden met cryostaat, met HE kleuring bekijken
onder lichtmicroscoop
• Afname van het weefsel, tijdens de operatie neemt men een stukje weefsel uit een letsel of tumor. Na het
afnemen moet het staal zsm verwerkt worden om afbraak van cellen en eiwitten te voorkomen.
• Fixatie, bij lichtmicroscopie in formol/formaldehyde, bij EM glutaaraldehyde. Maar meestal gebruikt men
lichtmicroscopie dus formol. Deze stap doet men om afbraak tegen te gaan, de structuren van het weefsel te
bewaren en het staal steviger te maken voor verdere verwerking.
• Ontwateren, het weefsel wordt gedehydrateerd om te voorkomen dat het gaat rotten en omdat het hierna
inbed wordt in een medium dat niet mengt met water.
• Inbedden, voor lichtmicroscopie wordt het weefsel ingebed in paraffine, dat zorgt ervoor dat het stevig
genoeg wordt om later dunne schijfjes te kunnen maken. (Bij EM in epoxiehars)
• snijden, nu worden er dunne schijfjes/coupes gemaakt. Voor lichtmicroscopie zijn deze3-10 microm dik. Het
moet zo dun zijn zodat licht erdoorheen kan en het preparaat goed zichtbaar wordt onder de microscoop.
• Op draagglas plaatsen, zodat ze verder gekleurd en onderzocht kunnen worden.
• Kleuring, het preparaat wordt gekleurd dmv empirische kleuring (vooral H&E kleuring),
enzymgebaseerdekleuring of immunohistochemie.
• Onderzoek met lichtmicroscoop, er wordt gekeken naar de algemene weefselstructuur, de ligging en vorm
van de cellen, afwijkingen zoals ontstekingen of tumor en eventueel de aanwezigheid van specifieke eiwitten
via immunohistochemie.
• Diagnostische interpretatie, obv de microscopische bevindingen wordt een diagnose gesteld.
,Bij directe immunohistochemie is het primaire antilichaam zelf gelabeld met een enzym of kleur. Dat bindt dan
rechtstreeks aan het specifieke eiwit. Ze zouden dit gebruiken om dat het eenvoudig en snel is maar het is
duur en niet efficient omdat je voor elk eiwit opnieuw een gelabeld primair antilichaam moet maken.
Bij indirecte immunohistochemie gebruikt men eerst een ongelabeld primair AL dat aan het doelwit bindt,
daarna gebruikt men een gelabeld secundair AL dat bindt aan de primaire AL. Het secundaire AL is meestal
gericht tegen antilichamen van 1 bepaalde diersoort. Het wordt gebruikt omdat het goedkoper en praktischer is,
doordat meerdere primaire AL van dezelfde soort met hetzelfde secundaire AL gedetecteerd kunnen worden.
Het is ook handig om meerdere eiwitten tegelijk te onderzoekn door primaire AL uit verschillende diersoorten
te gebruiken, dan kan je verschillende secundaire AL gebruiken met verschillende labels.
Men gebruikt signaalamplificatie als de hoeveelheid doelwit-eiwit in het weefsel heel laag is.
Bv bij streptavidine, die heeft meerdere bindingsplaatsen en bindt sterk met biotine. Men gaat dus aan
secundair of primair AL biotine hangen. Zo krijg je een soort boomstructuur waar meerdere signaalmoleculen
of fluorescentiemerkers kunnen koppelen wat zorgt voor een duidelijkere detectie van eiwitten die in lage
concentratie aanwezig zijn.
Bij immunofluorescentie wordt de binding met het AL zichtbaar gemaakt met een fluorescente merker ipv met
een kleurreactie. Het werkt hetzelfde als immunohistochemie maar de detectie gebeurt via lichtemissie van een
fluorochroom. Men gebruikt dit omdat eiwitten gevoelig zijn voor detectie hiervan, het is geschikt om meerder
eiwitten tegelijk aan te tonen met verschillende kleuren en het geeft duidelijke lokalisering van eiwitten in
een cel of weefsel.
De verschillende methoden bestaan voor diagnotisch therapeutisch project (vb cytokinese), prognotisch doel en
therapeutische beslissing:
• Bij diagnostiek om bepaalde eiwitten te zoeken die de oorsprong van een tumor bepalen, vb CK20 komt voor
in gastro-intestinale systeem, CK8 in de lever, dus als men een CK20 in de lever aantreft weet men dat het
afkomstig is uit get gastro-intestinale stelsel.
• Bij prognose, als je bv een P16 eiwit vindt kan dat wijzen op een betere prognose, omdat dat de celcyclus
afremt.
• Bij therapeutische beslissing vindt men bv HER2 eiwit dat wijst op borstkanker, als die tot expressie komt kan
een Herceptin behandeling nuttig zijn, zonder HER2 zou die behandeling niet werken.
, • Empirische kleuring: dit gebeurt met de stoffen hematoxiline die een blauwe kleur geeft en eosine die een
rode kleur geeft. Dit is een techniek die is ontstaan door trial and error, het heeft te maken met de
elektrostatische aantrekking. Hematoxyline is een basische positief geladen kleurstof en eosine is een zure
negatief geladen kleurstof. De blauwe kleur bindt dus aan negatief geladen structuren en de rode kleur aan
positief geladen structuren.
• Enzym gebaseerde kleuring: kleurloos wordt omgezet naar kleur door enymatische activiteit. In het weefsel
zit een bepaald enzym, door het toevoegen van een (meestal kleurloos) substraat, gaat het enzym dat
substraat omzetten in een gekleurd product, dat slaat neer op de plek waar het enzym zit.
• Immunohistochemie, specifieke eiwitten in het weefsel worden zichtbaar gemaakt met antilichamen. Een
antilichaam bindt specifiek aan een bepaald eiwit in het weefsel. Dat antilichaam is gekoppeld aan een enzym
of fluorescentie, dat zorgt voor een kleurreactie of lichtsignaal. Je kan immunohistochemie onderscheiden in
directe, indirect en geamplificeerde immunohistochemie of fluorescentie.
◦directe: gelabeld primair AL bindt rechtstreeks aan antigeen, snel en eenvoudig, minder gevoelig en duur
◦Indirecte: primair AL en gelabeld secundair AL, sterk signaal en goedkoper, felxibeler
◦geamplificeerde immunohistochemie: extra signaalversterking, zeer gevoelig, geschikt bij weinig eiwit
◦Immunofluorescentie: antilichaam met fluorescente label, signaal zichtbaar onder
fluorescentiemicroscoop, meerdere eiwitten tegelijk mogelijk.
