Levensmiddelenmicrobiologie hoofdstuk:4
Hoofdstuk 4: microbiologisch
onderzoek van levensmiddelen
Inhoud
1.1 Inleiding..............................................................................................3
1.2 Algemene principes van microbiologische analyses...........................3
1.2.1 Staalname en transport................................................................3
1.2.2 Cultuurmedia................................................................................4
1.2.3 Bereiden en verdunnen van de monsters.....................................5
1.2.4 Rescuscitatie en (voor)aanrijking..................................................7
1.2.5 Kwantitatieve plaatmethode (telling)...........................................9
1.2.6 Kwalitatieve methoden...............................................................11
1.2.7 Bevestiging en identificatie van micro-organismen....................13
1.2.8 Microbiologische criteria.............................................................13
1.2.9 Bemonsteringsschema’s.............................................................20
1.3 Onderzoek naar bederfveroorzakende kiemen.................................20
1.3.1 Totaal kiemgetal (TKG)................................................................20
1.3.2 Melkzuurbacteriën......................................................................22
1.3.3 Gisten en schimmels...................................................................23
1.4 Onderzoek naar hygiëne-indicatoren................................................23
1.4.1 Methodologie voor bepaling van Enterobacteriaceae.................24
1.4.2 Methodologie voor bepaling van coliformen...............................26
1.4.3 Methodologie voor bepaling van E.coli.......................................27
1.4.4 Gelijktijdige bepaling van E. coli/ coliformen..............................28
1.4.5 Methodologie voor de bepaling van Enterococcen.....................28
1.4.6 Bepaling van Staphylococcus aureus.........................................29
1.5 Onderzoek naar pathogenen............................................................30
1.5.1 Onderzoek naar voedselinfectanten...........................................31
1.5.2 Onderzoek naar voedselintoxicanten.........................................36
1.6 Bevestiging en identificatie van micro-organismen..........................39
1.6.1 Inleiding......................................................................................39
1.6.2 De reinstrijk als voorbereidende stap.........................................41
1
,Levensmiddelenmicrobiologie hoofdstuk:4
1.6.3 Fenotypische testen....................................................................41
1.6.4 Alternatieve testen.....................................................................43
1.7 Onderzoek naar de productie-omgeving...........................................45
1.7.1 Inleiding: contaminatie van lucht en oppervlakken....................45
1.7.2 Methoden voor omgevingscontrole: materiaal en technieken voor
bemonstering van lucht en oppervlakken............................................50
1.8 Alternatieve methoden.....................................................................55
1.8.1 DNA-gebaseerde methoden........................................................55
1.8.2 Chemotaxonomie........................................................................64
2
,Levensmiddelenmicrobiologie hoofdstuk:4
1.1 Inleiding
Traditionele microbiologische analysemethoden= cultuurmethoden
Cultuurmethoden: gebaseerd op het cultuur brengen van M.O. op
voedingsbodems
Nadeel: traag en arbeidsintensief=> probleem in voedingsindustrie
Er is nood aan een alternatieve snellere microbiologische
analysemethoden zoals vb. immunologische methoden, DNA-
gebaseerde methoden
Klassieke analysemethoden blijven nodig!!!
Nog geen snellere methoden voor alle groepen
van M.O.
Bruikbaar voor onderzoek naar eigenschappen
van M.O.
1.2 Algemene principes van microbiologische analyses
1.2.1Staalname en transport
1.2.1.1 Aandachtspunten bij staalname
Staalname mag microbiële samenstelling niet veranderen (besmetting
voorkomen) => steriel/aseptisch werken
Steriel gereedschap:
o Wegwerp vb. steriele monsterpotjes
o Bij meermaals gebrui vb. messen in productie: tussentijdse
reiniging en ontsmetting door flamberen (al of niet met
ethanol)
Goede registratie en codering van monsters: traceerbaarheid
1.2.1.2 Aandachtspunten bij transport, bewaring, ontvangst en registratie
Bewaring:
Niet bederfelijke LM=> kamertemperatuur (18° à 27°C of T°
waarbij bewaard/ gebruikt)
Bederfelijke LM (incl. waterstalen) => frigo (5 ± 3°C)
Diepgevroren LM => <-15°C, bij voorkeur <-18°C
Oppervlaktemonsters (swabs, afdrukplaatjes)=> 1 à 8°C
Transport
Temperaturen volgens bewaarcondities
Geïsoleerde kisten met koelementen- smeltend ijs- droog ijs (CO2, !
gevaar voor celbeschadiging)
3
, Levensmiddelenmicrobiologie hoofdstuk:4
Goede temperatuurcontrole via datalogger of zelfregistrerende
thermometer
Ontvangst en registratie
Visuele inspectie, temperatuur meten, registratie in LIMS*
(Laboratory Information Management System)
Zo snel mogelijk onderzoeken (<24 uur) behalve niet bederfelijke
LM
Eventueel in diepvries bewaren maar bij voorkeur niet
Rekening houden met secifiekere opslageisen vb. verse vis <2°C
1.2.2Cultuurmedia
1.2.2.1 Soorten cultuurmedia
Vloeibare media
Vaste media
Algemene of niet-selectieve media
Selectieve media
Differentiërende of electieve media
Aanrijkingsmedia
1.2.2.2 Samenstelling cultuurmedia
Water (gedestilleerd of gedemineraliseerd)
Voedingsstoffen: C-bron, N-bron, mineralen, sporenelementen,
vitaminen, …
Groeibevorderende stoffen vb. eiwitten, suikers, mineralen,…
Selectieve stoffen vb. antibiotica, galzouten, pH,…
Electieve of differentiërende stoffen
o Vaak combinatie van suiker + pH-kleurindicator
o Fluorogene en chromogene componenten:
Kleurstofvormende componenten => bij aanwezigheid van
bepaalde bacteriën en bijgevolg hun bacteriële enzymen
of hun bacteriële metabolieten, zal het chromogeen of
fluorogeen omgezet worden tot een kleur of gaan
fluoresceren
Vb. electieve: suiker lactose
Colformen kunnen lactose metaboliseren en hier zorgt het voor
verzuring=> kleur roze
Niet coliformen kunnen lactose niet metaboliseren en hier is dus
geen verzuring=> kleur geel
4
Hoofdstuk 4: microbiologisch
onderzoek van levensmiddelen
Inhoud
1.1 Inleiding..............................................................................................3
1.2 Algemene principes van microbiologische analyses...........................3
1.2.1 Staalname en transport................................................................3
1.2.2 Cultuurmedia................................................................................4
1.2.3 Bereiden en verdunnen van de monsters.....................................5
1.2.4 Rescuscitatie en (voor)aanrijking..................................................7
1.2.5 Kwantitatieve plaatmethode (telling)...........................................9
1.2.6 Kwalitatieve methoden...............................................................11
1.2.7 Bevestiging en identificatie van micro-organismen....................13
1.2.8 Microbiologische criteria.............................................................13
1.2.9 Bemonsteringsschema’s.............................................................20
1.3 Onderzoek naar bederfveroorzakende kiemen.................................20
1.3.1 Totaal kiemgetal (TKG)................................................................20
1.3.2 Melkzuurbacteriën......................................................................22
1.3.3 Gisten en schimmels...................................................................23
1.4 Onderzoek naar hygiëne-indicatoren................................................23
1.4.1 Methodologie voor bepaling van Enterobacteriaceae.................24
1.4.2 Methodologie voor bepaling van coliformen...............................26
1.4.3 Methodologie voor bepaling van E.coli.......................................27
1.4.4 Gelijktijdige bepaling van E. coli/ coliformen..............................28
1.4.5 Methodologie voor de bepaling van Enterococcen.....................28
1.4.6 Bepaling van Staphylococcus aureus.........................................29
1.5 Onderzoek naar pathogenen............................................................30
1.5.1 Onderzoek naar voedselinfectanten...........................................31
1.5.2 Onderzoek naar voedselintoxicanten.........................................36
1.6 Bevestiging en identificatie van micro-organismen..........................39
1.6.1 Inleiding......................................................................................39
1.6.2 De reinstrijk als voorbereidende stap.........................................41
1
,Levensmiddelenmicrobiologie hoofdstuk:4
1.6.3 Fenotypische testen....................................................................41
1.6.4 Alternatieve testen.....................................................................43
1.7 Onderzoek naar de productie-omgeving...........................................45
1.7.1 Inleiding: contaminatie van lucht en oppervlakken....................45
1.7.2 Methoden voor omgevingscontrole: materiaal en technieken voor
bemonstering van lucht en oppervlakken............................................50
1.8 Alternatieve methoden.....................................................................55
1.8.1 DNA-gebaseerde methoden........................................................55
1.8.2 Chemotaxonomie........................................................................64
2
,Levensmiddelenmicrobiologie hoofdstuk:4
1.1 Inleiding
Traditionele microbiologische analysemethoden= cultuurmethoden
Cultuurmethoden: gebaseerd op het cultuur brengen van M.O. op
voedingsbodems
Nadeel: traag en arbeidsintensief=> probleem in voedingsindustrie
Er is nood aan een alternatieve snellere microbiologische
analysemethoden zoals vb. immunologische methoden, DNA-
gebaseerde methoden
Klassieke analysemethoden blijven nodig!!!
Nog geen snellere methoden voor alle groepen
van M.O.
Bruikbaar voor onderzoek naar eigenschappen
van M.O.
1.2 Algemene principes van microbiologische analyses
1.2.1Staalname en transport
1.2.1.1 Aandachtspunten bij staalname
Staalname mag microbiële samenstelling niet veranderen (besmetting
voorkomen) => steriel/aseptisch werken
Steriel gereedschap:
o Wegwerp vb. steriele monsterpotjes
o Bij meermaals gebrui vb. messen in productie: tussentijdse
reiniging en ontsmetting door flamberen (al of niet met
ethanol)
Goede registratie en codering van monsters: traceerbaarheid
1.2.1.2 Aandachtspunten bij transport, bewaring, ontvangst en registratie
Bewaring:
Niet bederfelijke LM=> kamertemperatuur (18° à 27°C of T°
waarbij bewaard/ gebruikt)
Bederfelijke LM (incl. waterstalen) => frigo (5 ± 3°C)
Diepgevroren LM => <-15°C, bij voorkeur <-18°C
Oppervlaktemonsters (swabs, afdrukplaatjes)=> 1 à 8°C
Transport
Temperaturen volgens bewaarcondities
Geïsoleerde kisten met koelementen- smeltend ijs- droog ijs (CO2, !
gevaar voor celbeschadiging)
3
, Levensmiddelenmicrobiologie hoofdstuk:4
Goede temperatuurcontrole via datalogger of zelfregistrerende
thermometer
Ontvangst en registratie
Visuele inspectie, temperatuur meten, registratie in LIMS*
(Laboratory Information Management System)
Zo snel mogelijk onderzoeken (<24 uur) behalve niet bederfelijke
LM
Eventueel in diepvries bewaren maar bij voorkeur niet
Rekening houden met secifiekere opslageisen vb. verse vis <2°C
1.2.2Cultuurmedia
1.2.2.1 Soorten cultuurmedia
Vloeibare media
Vaste media
Algemene of niet-selectieve media
Selectieve media
Differentiërende of electieve media
Aanrijkingsmedia
1.2.2.2 Samenstelling cultuurmedia
Water (gedestilleerd of gedemineraliseerd)
Voedingsstoffen: C-bron, N-bron, mineralen, sporenelementen,
vitaminen, …
Groeibevorderende stoffen vb. eiwitten, suikers, mineralen,…
Selectieve stoffen vb. antibiotica, galzouten, pH,…
Electieve of differentiërende stoffen
o Vaak combinatie van suiker + pH-kleurindicator
o Fluorogene en chromogene componenten:
Kleurstofvormende componenten => bij aanwezigheid van
bepaalde bacteriën en bijgevolg hun bacteriële enzymen
of hun bacteriële metabolieten, zal het chromogeen of
fluorogeen omgezet worden tot een kleur of gaan
fluoresceren
Vb. electieve: suiker lactose
Colformen kunnen lactose metaboliseren en hier zorgt het voor
verzuring=> kleur roze
Niet coliformen kunnen lactose niet metaboliseren en hier is dus
geen verzuring=> kleur geel
4
