INSTRUMENTELE ANALYSE
HA1: KWANTITATIEVE ANALYSES EN METHODEVALIDATIE
GEEF HET VERSCHIL TUSSEN DIRECTE METING EN METING VIA EEN IJKLIJN. GEEF DE
VERSCHILLENDE IJKMETHODES
1. Directe bepaling en bepaling na ijking
Directe bepaling Bepaling via ijking
Het gehalte wordt rechtstreeks afgeleid uit Het gehalte wordt bepaald door het meetsignaal van
een gemeten grootheid, zonder dat een de onbekende te vergelijken met dat van gekende
calibratie met standaarden nodig is. standaarden.
Gebaseerd op stoichiometrische Gebaseerd op een empirisch verband tussen signaal
relaties of wetmatige verbanden. en concentratie.
Voorbeelden: gravimetrie (wegen van Voorbeelden: spectrofotometrie, chromatografie,
neerslag), titratie (volume en concentratie atoomabsorptie, elektrochemie.
titrant).
Er wordt geen ijklijn opgesteld. Een ijklijn (calibratielijn) wordt opgesteld via lineaire
regressie: y=b0 +b1 x .
Geen calibratie-onzekerheid: de fout zit Er is onzekerheid op de schatting van b 0 en b 1. Deze
enkel in de meting zelf (weegfout, onzekerheid werkt door in de concentratiebepaling
titreerfout). van de onbekende.
Geen lineariteitsvereiste: de methode is Lineariteit moet worden gecontroleerd: men moet
inherent lineair door stoichiometrie. nagaan of de ijklijn recht is binnen het gebruikte
concentratiegebied.
Geen extrapolatie: men meet binnen het Extrapolatie buiten het gemeten ijkgebied is uit den
bereik van de methode. boze: men weet niet of het lineair verband daar nog
geldt.
Blanco-correctie: soms nodig (bv. tare wegen Blanco-correctie is essentieel: reagensblanco en
bij gravimetrie). matrixblanco worden afgetrokken om systematische
fouten te vermijden.
Vooral geschikt Geschikt voor sporenanalyse en lage concentraties,
voor hoofdbestanddelen (hoge mits goede calibratie.
concentraties).
KLASSIEKE IJKLIJN (MEERPUNTSIJKING)
Werkwijze:
Meerdere standaarden met gekende concentraties worden gemeten. De meetresultaten
(signalen) worden uitgezet tegen de concentraties. Via de methode der kleinste
kwadraten wordt de best passende rechte bepaald:
y=b0 +b1 x
Waarom zo werken?
1
,De methode corrigeert voor toevallige fouten op de metingen van de standaarden.Men
bekomt een schatting van de ware calibratielijn ( β 0 en β 1) met
bijhorende onzekerheid (betrouwbaarheidsintervallen).
Onzekerheid op de concentratiebepaling:
De onzekerheid op b 0 en b 1 veroorzaakt een onzekerheid op de berekende concentratie van
de onbekende.
Belangrijk: De onzekerheid is het kleinst wanneer de onbekende in het midden van de
ijklijn valt. Hoe breder de range van de ijklijn, hoe kleiner de onzekerheid (mits lineariteit
behouden blijft).
Lineair gebied:
Men moet controleren of de ijklijn binnen het gebruikte concentratiegebied voldoende
recht is.
Het lineaire gebied is het concentratiegebied waarin het verband tussen signaal en
concentratie door een rechte kan worden beschreven. Bepaling gebeurt via statistische tests
(bv. gebrek aan fit-test, residualenanalyse).
Extrapolatie:
Extrapolatie buiten het gemeten ijkgebied is verboden! Men weet niet of het lineair
verband daar nog geldt.
De ijkrange moet daarom worden gekozen in functie van de verwachte concentraties in de
stalen.
EÉNPUNTSIJKING
Werkwijze:
Slechts één standaard met gekende concentratie (C standaard) wordt gemeten.
Het signaal van de onbekende (Y x) wordt vergeleken met dat van de standaard (Y standaard ).
De concentratie van de onbekende wordt berekend via de regel van drie:
Yx
C x= × Cstandaard
Y standaard
Onderliggende veronderstelling:
De ijklijn is een rechte die door de oorsprong (0,0) en het punt ( C standaard ,Y standaard ) gaat. Met
andere woorden: men veronderstelt dat b 0=0 en dat de helling constant is.
Wanneer toepassen?
Bij methoden waar de blanco verwaarloosbaar is of reeds is afgetrokken. Bij snelle
routineanalyses waar een volledige ijklijn te omslachtig is.
Voorwaarde: men moet zeker zijn dat de methode lineair is door de oorsprong.
Beperkingen:
Geen correctie voor eventuele afwijkingen van de veronderstelde helling. Geen zicht op de
lineariteit. Geen schatting van de onzekerheid op de calibratie.
ZONDER IJKING (GEBRUIK VAN GEKENDE COËFFICIËNTEN)
Werkwijze:
Bij UV-VIS spectrometrie wordt soms gebruik gemaakt van de specifieke
1%
absorptiecoëfficiënt A1 cm of de molaire absorptiecoëfficiënt ε , zoals opgegeven in de
farmacopee.
De concentratie wordt berekend via de wet van Lambert-Beer:
1%
A=ε ⋅c ⋅ lof A=A 1 cm ⋅c ⋅l
2
,Waarom is dit mogelijk?
De calibratie is reeds uitgevoerd door de Farmacopeecommissie. De opgegeven
coëfficiënt is een maat voor de richtingscoëfficiënt van de ijklijn.
Verantwoordelijkheid van de analyst:
De analyst moet niet zelf een ijklijn maken, maar moet wel: Het
toestel kalibreren (golflengte- en absorptie-ijs correct instellen)
Nagaan of het toestel naar behoren werktµ. Controleren of de meting binnen het lineaire
gebied valt
Voorbeeld:
Bepaling van paracetamol in een tablet via UV-spectrometrie bij 257 nm, gebruik makend van
1%
de A1 cm uit de monografie.
INWENDIGE (INTERNE) STANDAARD
Werkwijze:
Een constante hoeveelheid van
een interne standaard (IS) wordt
toegevoegd aan:
Alle standaarden
Alle onbekende stalen
De blanco
Voor elk staal wordt de verhouding van de signalen berekend:
Signaal analyt
Responsverhouding=
Signaal IS
Oppervlakte analyt
Bij chromatografie:
Oppervlakte IS
Deze verhouding wordt uitgezet tegen de concentratie van de analyt in de standaarden om de
ijklijn op te stellen.
De concentratie in de onbekende wordt afgelezen uit deze ijklijn.
Doel:
Corrigeren voor toevallige fouten die optreden tijdens de staalvoorbehandeling en/of
meting.
De interne standaard ondergaat dezelfde behandelingen als de analyt, waardoor variaties
worden genormaliseerd.
Waarvoor corrigeert de interne standaard?
Injectievariabiliteit: bij gaschromatografie (GC) en capillaire elektroforese (CE) kan het
geïnjecteerde volume variëren; de IS corrigeert hiervoor.
Extractievariabiliteit: bij staalvoorbehandeling met extractie (bv. bioanalyse) kan de
extractieopbrengst variëren; de IS corrigeert omdat beide in dezelfde verhouding worden
geëxtraheerd.
Derivatisatie-opbrengst: bij GC-analyse waar derivatisatie nodig is, corrigeert de IS voor
variaties in de reactieopbrengst.
Instrumentele fluctuaties: variaties in detectorgevoeligheid, temperatuur, etc.
Voorwaarden voor een goede interne standaard:
De IS moet chemisch en fysisch vergelijkbaar zijn met de analyt.
Ze mag niet in het staal voorkomen.
STANDAARDADDITIE
Principe:
3
, De standaardadditie wordt toegepast wanneer geen blanco-matrix beschikbaar
is (bv. bepaling van ijzer in bloed, bepaling van een geneesmiddel in een biologisch
staal).
De matrix bevat steeds de te bepalen
component, zodat een echte blanco niet
kan worden gemaakt.
De methode corrigeert
voor matrixeffecten die de helling van de
ijklijn beïnvloeden.
Eénpunts standaardadditie
Werkwijze:
1. Men meet het signaal van het oorspronkelijke staal: Y x
2. Men voegt een gekende hoeveelheid C t van de te bepalen component toe aan een
tweede aliquot van het staal.
3. Men meet het signaal van dit "gespikete" staal: Y ( x+t )
4. De concentratie in het oorspronkelijke staal wordt berekend via:
Y x ⋅C t
C x=
Y ( x+t )−Y x
Veronderstelling:
Het signaal is lineair evenredig met de concentratie.
De toevoeging veroorzaakt geen verandering in de matrix die het signaal
beïnvloedt.
Voordeel:
Eenvoudig en snel.
Corrigeert voor matrixeffecten (mits deze constant zijn over het
concentratiegebied).
Nadeel:
Gebaseerd op slechts één toevoeging → gevoelig voor toevallige fouten.
Geeft geen informatie over de lineariteit.
Meerpunts standaardadditie
Werkwijze:
1. Aan verschillende aliquots van hetzelfde staal worden oplopende gekende
hoeveelheden van de te bepalen component toegevoegd.
2. Alle stalen worden gemeten.
3. De gemeten signalen worden uitgezet tegen de toegevoegde concentraties.
4. De punten worden gefit met een rechte (lineaire regressie).
5. De rechte wordt geëxtrapoleerd naar de x-as (waar y=0).
6. Het snijpunt met de x-as (in absolute waarde) is de concentratie in het
oorspronkelijke staal.
Waarom werkt dit?
De vergelijking van de rechte is: Y =b0 +b1 ⋅ C toegevoegd
Voor het oorspronkelijke staal (zonder toevoeging) geldt: Y x =b0
Wanneer Y =0, dan is C toegevoegd =−b 0 /b1
4
HA1: KWANTITATIEVE ANALYSES EN METHODEVALIDATIE
GEEF HET VERSCHIL TUSSEN DIRECTE METING EN METING VIA EEN IJKLIJN. GEEF DE
VERSCHILLENDE IJKMETHODES
1. Directe bepaling en bepaling na ijking
Directe bepaling Bepaling via ijking
Het gehalte wordt rechtstreeks afgeleid uit Het gehalte wordt bepaald door het meetsignaal van
een gemeten grootheid, zonder dat een de onbekende te vergelijken met dat van gekende
calibratie met standaarden nodig is. standaarden.
Gebaseerd op stoichiometrische Gebaseerd op een empirisch verband tussen signaal
relaties of wetmatige verbanden. en concentratie.
Voorbeelden: gravimetrie (wegen van Voorbeelden: spectrofotometrie, chromatografie,
neerslag), titratie (volume en concentratie atoomabsorptie, elektrochemie.
titrant).
Er wordt geen ijklijn opgesteld. Een ijklijn (calibratielijn) wordt opgesteld via lineaire
regressie: y=b0 +b1 x .
Geen calibratie-onzekerheid: de fout zit Er is onzekerheid op de schatting van b 0 en b 1. Deze
enkel in de meting zelf (weegfout, onzekerheid werkt door in de concentratiebepaling
titreerfout). van de onbekende.
Geen lineariteitsvereiste: de methode is Lineariteit moet worden gecontroleerd: men moet
inherent lineair door stoichiometrie. nagaan of de ijklijn recht is binnen het gebruikte
concentratiegebied.
Geen extrapolatie: men meet binnen het Extrapolatie buiten het gemeten ijkgebied is uit den
bereik van de methode. boze: men weet niet of het lineair verband daar nog
geldt.
Blanco-correctie: soms nodig (bv. tare wegen Blanco-correctie is essentieel: reagensblanco en
bij gravimetrie). matrixblanco worden afgetrokken om systematische
fouten te vermijden.
Vooral geschikt Geschikt voor sporenanalyse en lage concentraties,
voor hoofdbestanddelen (hoge mits goede calibratie.
concentraties).
KLASSIEKE IJKLIJN (MEERPUNTSIJKING)
Werkwijze:
Meerdere standaarden met gekende concentraties worden gemeten. De meetresultaten
(signalen) worden uitgezet tegen de concentraties. Via de methode der kleinste
kwadraten wordt de best passende rechte bepaald:
y=b0 +b1 x
Waarom zo werken?
1
,De methode corrigeert voor toevallige fouten op de metingen van de standaarden.Men
bekomt een schatting van de ware calibratielijn ( β 0 en β 1) met
bijhorende onzekerheid (betrouwbaarheidsintervallen).
Onzekerheid op de concentratiebepaling:
De onzekerheid op b 0 en b 1 veroorzaakt een onzekerheid op de berekende concentratie van
de onbekende.
Belangrijk: De onzekerheid is het kleinst wanneer de onbekende in het midden van de
ijklijn valt. Hoe breder de range van de ijklijn, hoe kleiner de onzekerheid (mits lineariteit
behouden blijft).
Lineair gebied:
Men moet controleren of de ijklijn binnen het gebruikte concentratiegebied voldoende
recht is.
Het lineaire gebied is het concentratiegebied waarin het verband tussen signaal en
concentratie door een rechte kan worden beschreven. Bepaling gebeurt via statistische tests
(bv. gebrek aan fit-test, residualenanalyse).
Extrapolatie:
Extrapolatie buiten het gemeten ijkgebied is verboden! Men weet niet of het lineair
verband daar nog geldt.
De ijkrange moet daarom worden gekozen in functie van de verwachte concentraties in de
stalen.
EÉNPUNTSIJKING
Werkwijze:
Slechts één standaard met gekende concentratie (C standaard) wordt gemeten.
Het signaal van de onbekende (Y x) wordt vergeleken met dat van de standaard (Y standaard ).
De concentratie van de onbekende wordt berekend via de regel van drie:
Yx
C x= × Cstandaard
Y standaard
Onderliggende veronderstelling:
De ijklijn is een rechte die door de oorsprong (0,0) en het punt ( C standaard ,Y standaard ) gaat. Met
andere woorden: men veronderstelt dat b 0=0 en dat de helling constant is.
Wanneer toepassen?
Bij methoden waar de blanco verwaarloosbaar is of reeds is afgetrokken. Bij snelle
routineanalyses waar een volledige ijklijn te omslachtig is.
Voorwaarde: men moet zeker zijn dat de methode lineair is door de oorsprong.
Beperkingen:
Geen correctie voor eventuele afwijkingen van de veronderstelde helling. Geen zicht op de
lineariteit. Geen schatting van de onzekerheid op de calibratie.
ZONDER IJKING (GEBRUIK VAN GEKENDE COËFFICIËNTEN)
Werkwijze:
Bij UV-VIS spectrometrie wordt soms gebruik gemaakt van de specifieke
1%
absorptiecoëfficiënt A1 cm of de molaire absorptiecoëfficiënt ε , zoals opgegeven in de
farmacopee.
De concentratie wordt berekend via de wet van Lambert-Beer:
1%
A=ε ⋅c ⋅ lof A=A 1 cm ⋅c ⋅l
2
,Waarom is dit mogelijk?
De calibratie is reeds uitgevoerd door de Farmacopeecommissie. De opgegeven
coëfficiënt is een maat voor de richtingscoëfficiënt van de ijklijn.
Verantwoordelijkheid van de analyst:
De analyst moet niet zelf een ijklijn maken, maar moet wel: Het
toestel kalibreren (golflengte- en absorptie-ijs correct instellen)
Nagaan of het toestel naar behoren werktµ. Controleren of de meting binnen het lineaire
gebied valt
Voorbeeld:
Bepaling van paracetamol in een tablet via UV-spectrometrie bij 257 nm, gebruik makend van
1%
de A1 cm uit de monografie.
INWENDIGE (INTERNE) STANDAARD
Werkwijze:
Een constante hoeveelheid van
een interne standaard (IS) wordt
toegevoegd aan:
Alle standaarden
Alle onbekende stalen
De blanco
Voor elk staal wordt de verhouding van de signalen berekend:
Signaal analyt
Responsverhouding=
Signaal IS
Oppervlakte analyt
Bij chromatografie:
Oppervlakte IS
Deze verhouding wordt uitgezet tegen de concentratie van de analyt in de standaarden om de
ijklijn op te stellen.
De concentratie in de onbekende wordt afgelezen uit deze ijklijn.
Doel:
Corrigeren voor toevallige fouten die optreden tijdens de staalvoorbehandeling en/of
meting.
De interne standaard ondergaat dezelfde behandelingen als de analyt, waardoor variaties
worden genormaliseerd.
Waarvoor corrigeert de interne standaard?
Injectievariabiliteit: bij gaschromatografie (GC) en capillaire elektroforese (CE) kan het
geïnjecteerde volume variëren; de IS corrigeert hiervoor.
Extractievariabiliteit: bij staalvoorbehandeling met extractie (bv. bioanalyse) kan de
extractieopbrengst variëren; de IS corrigeert omdat beide in dezelfde verhouding worden
geëxtraheerd.
Derivatisatie-opbrengst: bij GC-analyse waar derivatisatie nodig is, corrigeert de IS voor
variaties in de reactieopbrengst.
Instrumentele fluctuaties: variaties in detectorgevoeligheid, temperatuur, etc.
Voorwaarden voor een goede interne standaard:
De IS moet chemisch en fysisch vergelijkbaar zijn met de analyt.
Ze mag niet in het staal voorkomen.
STANDAARDADDITIE
Principe:
3
, De standaardadditie wordt toegepast wanneer geen blanco-matrix beschikbaar
is (bv. bepaling van ijzer in bloed, bepaling van een geneesmiddel in een biologisch
staal).
De matrix bevat steeds de te bepalen
component, zodat een echte blanco niet
kan worden gemaakt.
De methode corrigeert
voor matrixeffecten die de helling van de
ijklijn beïnvloeden.
Eénpunts standaardadditie
Werkwijze:
1. Men meet het signaal van het oorspronkelijke staal: Y x
2. Men voegt een gekende hoeveelheid C t van de te bepalen component toe aan een
tweede aliquot van het staal.
3. Men meet het signaal van dit "gespikete" staal: Y ( x+t )
4. De concentratie in het oorspronkelijke staal wordt berekend via:
Y x ⋅C t
C x=
Y ( x+t )−Y x
Veronderstelling:
Het signaal is lineair evenredig met de concentratie.
De toevoeging veroorzaakt geen verandering in de matrix die het signaal
beïnvloedt.
Voordeel:
Eenvoudig en snel.
Corrigeert voor matrixeffecten (mits deze constant zijn over het
concentratiegebied).
Nadeel:
Gebaseerd op slechts één toevoeging → gevoelig voor toevallige fouten.
Geeft geen informatie over de lineariteit.
Meerpunts standaardadditie
Werkwijze:
1. Aan verschillende aliquots van hetzelfde staal worden oplopende gekende
hoeveelheden van de te bepalen component toegevoegd.
2. Alle stalen worden gemeten.
3. De gemeten signalen worden uitgezet tegen de toegevoegde concentraties.
4. De punten worden gefit met een rechte (lineaire regressie).
5. De rechte wordt geëxtrapoleerd naar de x-as (waar y=0).
6. Het snijpunt met de x-as (in absolute waarde) is de concentratie in het
oorspronkelijke staal.
Waarom werkt dit?
De vergelijking van de rechte is: Y =b0 +b1 ⋅ C toegevoegd
Voor het oorspronkelijke staal (zonder toevoeging) geldt: Y x =b0
Wanneer Y =0, dan is C toegevoegd =−b 0 /b1
4
