Inhoud
Inhoud ................................................................................................................ 1
Wat is biotechnologie?......................................................................................... 6
Historische voorbeelden ...................................................................................... 6
Productie van antibiotica ....................................................................................... 6
Vaccinatie ............................................................................................................ 6
Belang van biotechnologie ................................................................................... 6
Oorsprong eerste biotechnologische geneesmiddelen .......................................... 6
Insuline ................................................................................................................ 6
Humaan groei hormoon ......................................................................................... 7
Biotech vs. Farmaceutisch bedrijf? ...................................................................... 7
Conventioneel vs. Biologisch geneesmiddel? ....................................................... 7
Geschiedenis van de biotechnologie .................................................................... 8
Centraal dogma ................................................................................................... 8
DNA replicatie ...................................................................................................... 9
Transcriptie .......................................................................................................... 9
Translatie ............................................................................................................. 9
Hoofdstuk 2: manipuleren van DNA .................................................................... 11
Plasmiden ......................................................................................................... 11
Bacterieel DNA ................................................................................................... 11
Type plasmiden .................................................................................................. 11
Plasmide als hulpmiddel ..................................................................................... 12
Plasmiden in biotechnologie ................................................................................ 12
Restrictie enzymen ............................................................................................ 12
Hoe wordt het geknipt en geplakt?........................................................................ 13
DNA scheidingstechnieken ................................................................................ 14
DNA scheiden op basis van grootte ...................................................................... 14
Transformatie .................................................................................................... 15
Chemische transformatie .................................................................................... 15
Elektroporatie ..................................................................................................... 15
,DNA zuiveren..................................................................................................... 15
Fysicochemische eigenschappen van DNA en RNA ............................................... 15
Chromosomaal DNA isoleren .............................................................................. 16
Plasmide DNA isoleren ........................................................................................ 16
Bronnen van DNA .............................................................................................. 17
Uit het organisme zelf: genomische DNA .............................................................. 17
Uit het organisme zelf: mRNA ............................................................................... 18
Synthetisch DNA aanmaken ................................................................................ 20
Sequentiebepaling ............................................................................................ 21
Dideoxynucleotide sequencing (sanger sequencing) ............................................. 21
Hoofdstuk 3: productie proces recombinante eiwitten ........................................ 22
Productie systemen ........................................................................................... 22
Posttranslationele modificaties ......................................................................... 22
Glycosylatie ....................................................................................................... 23
Vorming zwavelbruggen ....................................................................................... 24
Proteolyse .......................................................................................................... 25
Post productie en zuivering .................................................................................. 25
Plasmiden voor expressie .................................................................................. 26
(regelbare) promotor ........................................................................................... 26
ribosome binding site .......................................................................................... 28
Coderende sequentie .......................................................................................... 28
Terminator sequentie .......................................................................................... 28
transformatie/ transfectie .................................................................................. 29
Transformatie ..................................................................................................... 29
Transfectie ......................................................................................................... 29
Transductie ........................................................................................................ 29
Eiwitproductie in gastheren ............................................................................... 30
Bacteriën ........................................................................................................... 30
Gisten ................................................................................................................ 31
transgene dieren ................................................................................................. 33
Planten .............................................................................................................. 33
Zoogdiercellen .................................................................................................... 33
,Eiwitproductie: technieken ................................................................................ 35
Kleinschalig productie ......................................................................................... 35
Industriële productie ........................................................................................... 35
Hoofdstuk 4: productie proces recombinante eiwitten: opzuivering ..................... 38
Introductie ........................................................................................................ 38
Staalvoorbereiding ............................................................................................ 38
Centrifugatie....................................................................................................... 38
Dialyse ............................................................................................................... 39
Cellen openbreken.............................................................................................. 39
Filtratie............................................................................................................... 40
Precipitatie ......................................................................................................... 40
Chromatografie ................................................................................................. 40
Ionenuitwisselingschromatografie ........................................................................ 41
Affiniteitschromatografie ..................................................................................... 42
Hydrofobe interactiechromatografie ..................................................................... 44
Gelfiltratie .......................................................................................................... 44
Hoofdstuk 5: eiwit karakterisatie ........................................................................ 45
Introductie ........................................................................................................ 45
Concentratie bepaling ....................................................................................... 45
UV spectrofotometrie .......................................................................................... 45
Indirect: Bradford Assay ...................................................................................... 46
Absolute kwantificatie ......................................................................................... 46
Scheiding op basis van grootte: SDS-PAGE.......................................................... 47
Western Blot ..................................................................................................... 48
Scheiding op basis van lading ............................................................................ 48
Native PAGE ....................................................................................................... 48
Isoelektrisch focussing ........................................................................................ 48
2D elektroforese ................................................................................................ 49
ELISA ................................................................................................................ 49
Directe ELISA ...................................................................................................... 49
Indirecte ELISA ................................................................................................... 50
Sandwich ELISA .................................................................................................. 50
, Competitie ELISA ................................................................................................ 50
Fluorescentie gebaseerde technieken ................................................................ 51
Introductie ......................................................................................................... 51
Microscopie ....................................................................................................... 51
Flow cytometrie .................................................................................................. 52
Quenching ......................................................................................................... 52
FRET .................................................................................................................. 53
Fluorescente eiwitten .......................................................................................... 53
Bioluminescentie .............................................................................................. 54
Reporter assays................................................................................................. 54
Surface plasmon resonance .............................................................................. 54
Hoofdstuk 6: enzymen gebruikt bij recombinante technologie ............................. 55
Restrictie enzymen ............................................................................................ 55
Ligasen ............................................................................................................. 55
Fosfatasen ........................................................................................................ 55
Kinasen ............................................................................................................. 55
Methyltransferasen ........................................................................................... 56
Polymerasen ..................................................................................................... 56
Nucleasen......................................................................................................... 56
Recombinasen .................................................................................................. 57
Hoofdstuk 7: PCR technieken ............................................................................. 58
Conventionele PCR............................................................................................ 58
site directed mutagenese .................................................................................. 58
Nested PCR ....................................................................................................... 60
Hot start PCR .................................................................................................... 60
Touch down PCR ................................................................................................ 60
Error prone PCR ................................................................................................. 61
kolonie PCR....................................................................................................... 61
Kwantitatieve PCR qPCR .................................................................................... 61
Digital PCR ........................................................................................................ 62
Hoofdstuk 8: DNA/RNA analyse & next generation sequencing ............................ 63
DNA-eiwit interactie .......................................................................................... 63
, Gel mobility shift assay ........................................................................................ 63
DNAse 1 foot printing .......................................................................................... 63
ChIP-Seq ............................................................................................................ 63
DNA/RNA: identificeren regio’s .......................................................................... 63
Nuclease S1 mapping ......................................................................................... 63
Primer extensie ................................................................................................... 64
DNA/RNA samenstelling bepalen (zonder sequencing) ........................................ 64
PCR blockers: SNP’s bepalen .............................................................................. 64
RAPD randomly amplified polymorphic DNA ......................................................... 64
RFLP restriction fragment length polymorphism .................................................... 65
AFLP amplified fragment length polymorfism ........................................................ 65
CAPS cleaved amplified polymorphic sequence ................................................... 66
PCR op VNTR (variable number of tandem repeats) regio’s ..................................... 66
LAMP loop-mediated isothermal AMPlification ...................................................... 66
Micro-arrays ....................................................................................................... 67
Next generation sequencing ............................................................................... 67
Second generation sequencing ............................................................................ 67
Third generation sequencing ................................................................................ 70
Dataverwerking & toepassingen ........................................................................... 70
,Farmaceutische biotechnologie
Wat is biotechnologie?
Het gebruik van levende organismen, of de producten van levende organismen, ten
behoeve van de mens of de menselijke omgeving om een product te maken of een
probleem om te lossen
Bv. Antibiotica, vaccinatie, fermentatie…
Historische voorbeelden
Productie van antibiotica
Fleming: kweekplaat van Staphylococcus bacteriën besmet met penicillium notatum
onbedekt gelaten
➔ Bacterievrije zone in de buurt van de schimmel
➔ Bleek effectief tegen staphylococcus
➔ Penicilline als antibioticum
Vaccinatie
Melkmeisjes vaak in contact met koeien/koepokken → beschermd tegen
mensenpokken na blootstelling met koepokken (minder gevaarlijke versie van pokken)
Belang van biotechnologie
- Top 10 geneesmiddelen met grootste omzet: 6 biotechnologisch bv. Covid
- Grote biotech sector in België
- Belang zal alleen maar toenemen
Oorsprong eerste biotechnologische geneesmiddelen
Insuline
Wordt gesecreteerd door Bèta-cellen in pancreas en stimuleert opname van glucose
Diabetes type 1: slechte/geen werking van insuline
1921: insuline uit dieren geëxtraheerd en gezuiverd toegediend
➔ Allergische reactie (immuunsysteem) + zeer veel pancreassen nodig)
Menselijk insuline aanmaken dankzij bacteriën: DNA sequentie zoeken
,DNA synthese (100% gelijkend op die van de mens) in E.Coli succesvol
Humaan groei hormoon
Hormoon gesecreteerd door hypofyse, belangrijk voor groei tijdens kindertijd
Dwerggroei bij slechte/geen werking
1963: hormoon uit menselijke lijken gebruikt
1980: ziekte van Creutzfeldt-Jakob = prionziekte waarbij misgevouwen eiwitten
andere eiwitten aantasten en zo elk hun functie verliezen
➔ Degeneratie van hersenen
humaan groeihormoon obv recombinante DNA aangemaakt
= 2de goedgekeurde biotechnologisch geneesmiddel
Er is dus voldoende bron materiaal nodig en mogelijke contaminatie of reacties
vermijden
Biotechnologie dient dan als goede oplossing
Biotech vs. Farmaceutisch bedrijf?
Biotech Farmaceutisch
Medicijnontwikkeloing mbv levende Geneesmiddelontwikkeling zonder
organisme levende organismen te gebruiken
Ook andere producten Enkel medicijnen
Conventioneel vs. Biologisch geneesmiddel?
Conventioneel (klassiek chemisch gm) Biologisch
Chemische synthese Levende cellen
Laag moleculair gewicht (small Hoog moleculair gewicht
molecules)
Homogene structuur Complexe structuur
Finaal product onafhankelijk van Sterk proces afhankelijk (kleine
productieproces aanpassingen hebben groot effect)
Volledig gekarakteriseerd Moeilijk te karakteriseren (veel variabiliteit
Stabiel Afhankelijk van externe condities
Niet immunogeen Mogelijks immunogeen
, Geschiedenis van de biotechnologie
1590: 1663: 1675: 1796: eerste 1838: 1855: 1865:
uitvinding ontdekking ontdekking kleine pokken ontdekking ontdekking ontdekking
microscoop van de cel bacterie vaccinatie eiwitten E.Coli erfelijkheid
1919: ontstaan 1922: 1928: ontstaan 1941: ontstaan 1953: structuur 1961:
biotechnologie ontdekking penicilline als genetic gevonden van ontdekking
insuline antibiotica engineering DNA mRNA
1968: 1970: ontdekking 1977: E.Coli 1982: 1986: eerste 1989: mutaties
ontdekking 20 restrictie- gebruikt voor recombinant antilichaam leiden tot een
aminozuren enzymen insuline insuline geneesmiddel ziekte
1990: human 2003: volledig 1997: eerst
genome project menselijk genoom gecloneerd
gelanceerd gevonden zoogdier
Centraal dogma
DNA/RNA: uit nucleotiden
➔ Suiker (5-ring)
➔ 3 fosfaten
➔ Base (Adenine, thymine, cytosine, guanine, uracil)
➔ Dubbelstreng of enkelstreng
➔ Gebonden met fosfodiesterbinding
DNA: 2 strengen
5’→3’: sense, non-template, coding streng
3’→5’: anti-sense, template, non-coding streng
RNA: kopie van sense streng zonder thymine met uracil
Eiwit: aminozuursequentie
Inhoud ................................................................................................................ 1
Wat is biotechnologie?......................................................................................... 6
Historische voorbeelden ...................................................................................... 6
Productie van antibiotica ....................................................................................... 6
Vaccinatie ............................................................................................................ 6
Belang van biotechnologie ................................................................................... 6
Oorsprong eerste biotechnologische geneesmiddelen .......................................... 6
Insuline ................................................................................................................ 6
Humaan groei hormoon ......................................................................................... 7
Biotech vs. Farmaceutisch bedrijf? ...................................................................... 7
Conventioneel vs. Biologisch geneesmiddel? ....................................................... 7
Geschiedenis van de biotechnologie .................................................................... 8
Centraal dogma ................................................................................................... 8
DNA replicatie ...................................................................................................... 9
Transcriptie .......................................................................................................... 9
Translatie ............................................................................................................. 9
Hoofdstuk 2: manipuleren van DNA .................................................................... 11
Plasmiden ......................................................................................................... 11
Bacterieel DNA ................................................................................................... 11
Type plasmiden .................................................................................................. 11
Plasmide als hulpmiddel ..................................................................................... 12
Plasmiden in biotechnologie ................................................................................ 12
Restrictie enzymen ............................................................................................ 12
Hoe wordt het geknipt en geplakt?........................................................................ 13
DNA scheidingstechnieken ................................................................................ 14
DNA scheiden op basis van grootte ...................................................................... 14
Transformatie .................................................................................................... 15
Chemische transformatie .................................................................................... 15
Elektroporatie ..................................................................................................... 15
,DNA zuiveren..................................................................................................... 15
Fysicochemische eigenschappen van DNA en RNA ............................................... 15
Chromosomaal DNA isoleren .............................................................................. 16
Plasmide DNA isoleren ........................................................................................ 16
Bronnen van DNA .............................................................................................. 17
Uit het organisme zelf: genomische DNA .............................................................. 17
Uit het organisme zelf: mRNA ............................................................................... 18
Synthetisch DNA aanmaken ................................................................................ 20
Sequentiebepaling ............................................................................................ 21
Dideoxynucleotide sequencing (sanger sequencing) ............................................. 21
Hoofdstuk 3: productie proces recombinante eiwitten ........................................ 22
Productie systemen ........................................................................................... 22
Posttranslationele modificaties ......................................................................... 22
Glycosylatie ....................................................................................................... 23
Vorming zwavelbruggen ....................................................................................... 24
Proteolyse .......................................................................................................... 25
Post productie en zuivering .................................................................................. 25
Plasmiden voor expressie .................................................................................. 26
(regelbare) promotor ........................................................................................... 26
ribosome binding site .......................................................................................... 28
Coderende sequentie .......................................................................................... 28
Terminator sequentie .......................................................................................... 28
transformatie/ transfectie .................................................................................. 29
Transformatie ..................................................................................................... 29
Transfectie ......................................................................................................... 29
Transductie ........................................................................................................ 29
Eiwitproductie in gastheren ............................................................................... 30
Bacteriën ........................................................................................................... 30
Gisten ................................................................................................................ 31
transgene dieren ................................................................................................. 33
Planten .............................................................................................................. 33
Zoogdiercellen .................................................................................................... 33
,Eiwitproductie: technieken ................................................................................ 35
Kleinschalig productie ......................................................................................... 35
Industriële productie ........................................................................................... 35
Hoofdstuk 4: productie proces recombinante eiwitten: opzuivering ..................... 38
Introductie ........................................................................................................ 38
Staalvoorbereiding ............................................................................................ 38
Centrifugatie....................................................................................................... 38
Dialyse ............................................................................................................... 39
Cellen openbreken.............................................................................................. 39
Filtratie............................................................................................................... 40
Precipitatie ......................................................................................................... 40
Chromatografie ................................................................................................. 40
Ionenuitwisselingschromatografie ........................................................................ 41
Affiniteitschromatografie ..................................................................................... 42
Hydrofobe interactiechromatografie ..................................................................... 44
Gelfiltratie .......................................................................................................... 44
Hoofdstuk 5: eiwit karakterisatie ........................................................................ 45
Introductie ........................................................................................................ 45
Concentratie bepaling ....................................................................................... 45
UV spectrofotometrie .......................................................................................... 45
Indirect: Bradford Assay ...................................................................................... 46
Absolute kwantificatie ......................................................................................... 46
Scheiding op basis van grootte: SDS-PAGE.......................................................... 47
Western Blot ..................................................................................................... 48
Scheiding op basis van lading ............................................................................ 48
Native PAGE ....................................................................................................... 48
Isoelektrisch focussing ........................................................................................ 48
2D elektroforese ................................................................................................ 49
ELISA ................................................................................................................ 49
Directe ELISA ...................................................................................................... 49
Indirecte ELISA ................................................................................................... 50
Sandwich ELISA .................................................................................................. 50
, Competitie ELISA ................................................................................................ 50
Fluorescentie gebaseerde technieken ................................................................ 51
Introductie ......................................................................................................... 51
Microscopie ....................................................................................................... 51
Flow cytometrie .................................................................................................. 52
Quenching ......................................................................................................... 52
FRET .................................................................................................................. 53
Fluorescente eiwitten .......................................................................................... 53
Bioluminescentie .............................................................................................. 54
Reporter assays................................................................................................. 54
Surface plasmon resonance .............................................................................. 54
Hoofdstuk 6: enzymen gebruikt bij recombinante technologie ............................. 55
Restrictie enzymen ............................................................................................ 55
Ligasen ............................................................................................................. 55
Fosfatasen ........................................................................................................ 55
Kinasen ............................................................................................................. 55
Methyltransferasen ........................................................................................... 56
Polymerasen ..................................................................................................... 56
Nucleasen......................................................................................................... 56
Recombinasen .................................................................................................. 57
Hoofdstuk 7: PCR technieken ............................................................................. 58
Conventionele PCR............................................................................................ 58
site directed mutagenese .................................................................................. 58
Nested PCR ....................................................................................................... 60
Hot start PCR .................................................................................................... 60
Touch down PCR ................................................................................................ 60
Error prone PCR ................................................................................................. 61
kolonie PCR....................................................................................................... 61
Kwantitatieve PCR qPCR .................................................................................... 61
Digital PCR ........................................................................................................ 62
Hoofdstuk 8: DNA/RNA analyse & next generation sequencing ............................ 63
DNA-eiwit interactie .......................................................................................... 63
, Gel mobility shift assay ........................................................................................ 63
DNAse 1 foot printing .......................................................................................... 63
ChIP-Seq ............................................................................................................ 63
DNA/RNA: identificeren regio’s .......................................................................... 63
Nuclease S1 mapping ......................................................................................... 63
Primer extensie ................................................................................................... 64
DNA/RNA samenstelling bepalen (zonder sequencing) ........................................ 64
PCR blockers: SNP’s bepalen .............................................................................. 64
RAPD randomly amplified polymorphic DNA ......................................................... 64
RFLP restriction fragment length polymorphism .................................................... 65
AFLP amplified fragment length polymorfism ........................................................ 65
CAPS cleaved amplified polymorphic sequence ................................................... 66
PCR op VNTR (variable number of tandem repeats) regio’s ..................................... 66
LAMP loop-mediated isothermal AMPlification ...................................................... 66
Micro-arrays ....................................................................................................... 67
Next generation sequencing ............................................................................... 67
Second generation sequencing ............................................................................ 67
Third generation sequencing ................................................................................ 70
Dataverwerking & toepassingen ........................................................................... 70
,Farmaceutische biotechnologie
Wat is biotechnologie?
Het gebruik van levende organismen, of de producten van levende organismen, ten
behoeve van de mens of de menselijke omgeving om een product te maken of een
probleem om te lossen
Bv. Antibiotica, vaccinatie, fermentatie…
Historische voorbeelden
Productie van antibiotica
Fleming: kweekplaat van Staphylococcus bacteriën besmet met penicillium notatum
onbedekt gelaten
➔ Bacterievrije zone in de buurt van de schimmel
➔ Bleek effectief tegen staphylococcus
➔ Penicilline als antibioticum
Vaccinatie
Melkmeisjes vaak in contact met koeien/koepokken → beschermd tegen
mensenpokken na blootstelling met koepokken (minder gevaarlijke versie van pokken)
Belang van biotechnologie
- Top 10 geneesmiddelen met grootste omzet: 6 biotechnologisch bv. Covid
- Grote biotech sector in België
- Belang zal alleen maar toenemen
Oorsprong eerste biotechnologische geneesmiddelen
Insuline
Wordt gesecreteerd door Bèta-cellen in pancreas en stimuleert opname van glucose
Diabetes type 1: slechte/geen werking van insuline
1921: insuline uit dieren geëxtraheerd en gezuiverd toegediend
➔ Allergische reactie (immuunsysteem) + zeer veel pancreassen nodig)
Menselijk insuline aanmaken dankzij bacteriën: DNA sequentie zoeken
,DNA synthese (100% gelijkend op die van de mens) in E.Coli succesvol
Humaan groei hormoon
Hormoon gesecreteerd door hypofyse, belangrijk voor groei tijdens kindertijd
Dwerggroei bij slechte/geen werking
1963: hormoon uit menselijke lijken gebruikt
1980: ziekte van Creutzfeldt-Jakob = prionziekte waarbij misgevouwen eiwitten
andere eiwitten aantasten en zo elk hun functie verliezen
➔ Degeneratie van hersenen
humaan groeihormoon obv recombinante DNA aangemaakt
= 2de goedgekeurde biotechnologisch geneesmiddel
Er is dus voldoende bron materiaal nodig en mogelijke contaminatie of reacties
vermijden
Biotechnologie dient dan als goede oplossing
Biotech vs. Farmaceutisch bedrijf?
Biotech Farmaceutisch
Medicijnontwikkeloing mbv levende Geneesmiddelontwikkeling zonder
organisme levende organismen te gebruiken
Ook andere producten Enkel medicijnen
Conventioneel vs. Biologisch geneesmiddel?
Conventioneel (klassiek chemisch gm) Biologisch
Chemische synthese Levende cellen
Laag moleculair gewicht (small Hoog moleculair gewicht
molecules)
Homogene structuur Complexe structuur
Finaal product onafhankelijk van Sterk proces afhankelijk (kleine
productieproces aanpassingen hebben groot effect)
Volledig gekarakteriseerd Moeilijk te karakteriseren (veel variabiliteit
Stabiel Afhankelijk van externe condities
Niet immunogeen Mogelijks immunogeen
, Geschiedenis van de biotechnologie
1590: 1663: 1675: 1796: eerste 1838: 1855: 1865:
uitvinding ontdekking ontdekking kleine pokken ontdekking ontdekking ontdekking
microscoop van de cel bacterie vaccinatie eiwitten E.Coli erfelijkheid
1919: ontstaan 1922: 1928: ontstaan 1941: ontstaan 1953: structuur 1961:
biotechnologie ontdekking penicilline als genetic gevonden van ontdekking
insuline antibiotica engineering DNA mRNA
1968: 1970: ontdekking 1977: E.Coli 1982: 1986: eerste 1989: mutaties
ontdekking 20 restrictie- gebruikt voor recombinant antilichaam leiden tot een
aminozuren enzymen insuline insuline geneesmiddel ziekte
1990: human 2003: volledig 1997: eerst
genome project menselijk genoom gecloneerd
gelanceerd gevonden zoogdier
Centraal dogma
DNA/RNA: uit nucleotiden
➔ Suiker (5-ring)
➔ 3 fosfaten
➔ Base (Adenine, thymine, cytosine, guanine, uracil)
➔ Dubbelstreng of enkelstreng
➔ Gebonden met fosfodiesterbinding
DNA: 2 strengen
5’→3’: sense, non-template, coding streng
3’→5’: anti-sense, template, non-coding streng
RNA: kopie van sense streng zonder thymine met uracil
Eiwit: aminozuursequentie
