CEL II – CELBIOLOGIE
H1: prepareren en observeren van cellen en weefsels (kijk ook zeker naar notas)
1. doel: cellen en weefsels observeerbaar maken voor LM of EM
1.1. Celcultuur:
• Historiek:
à 3D weefselcultuur en 2D monolaagcultures, simuleren organen en weefsels
mbv orgaanexplanten (primair) in EMEM (Earle’s minimum essential medium)
à gebruik stabiele cellijnen met onbeperkte levensduur (tumoren of crisis)
à cultures → na x keren splitsen → veranderingen → sterven af → senescence
• stadia: tissue behandeld met enzymen → zakken/ centrifugatie = suspensie →
medium op petridish → primaire cultuur → confluente laag → secundaire
• condities
à MEM (minimal essential medium): isotone zouten (NaHCO3/H2CO3 buffer), energiebron,
essentiële aminozuren en vitamines, serum
à atmosfeer: 5% CO2 → goede pH = 7,4
• recipiënten: gesloten flessen, platen, rollerflessen, CO2 oven met cultuurplaten
• primaire culturen (eigen isolatie), andere labo’s, celbanken (vb ATTC)
1.2. groeisubstraten en procedures: doel in vivo = in vitro
• groeisubstraat: fysische drager + beschermt tegen anoikis (celdood), essentieel bij
adherente celculturen (buiten circulerende bloedcellen)
• materie: glas (-), coatings vb. poly-D-lysine, collageen (eiwit van ECM)
• signalen omliggende cellen nodig, nabootsen door medium (moedercultuur) of cellen op
feeder cellaag laten groeien
• vasthechting → beperkt celdood
• doel: adhesie, spreiding + interactie cellen of onderliggende en ECM (BM)
• cellen delen tot 2D monolaag → contactinhibitie van proliferatie
à herbeginnen? → nieuw medium of splitsen in dochterculturen
à tumoren: groeien in hoopjes door verlies contactinhibitie
• procedure celtransfer
à verdunning bij suspensieculturen
à adherente cellen → confluentie → behandeling trypsine / EDTA → cellen los
o magnocellulaire suspensie → verdunning
1
,1.3. stamcellen
= cel die vermogen heeft om zich voortdurend te delen en te differentiëren
(ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen/ weefsels
à 2 belangrijke eigenschappen:
1) het vermogen tot zelfvernieuwing, waarbij ze zichzelf delen en
kopieën van zichzelf maken
2) het vermogen om te differentiëren, waardoor de volwassen celtypen
ontstaan die onze organen en weefsels vormen
Proces:
• Na bevruchting (fertilisatie) ontstaat een zygote, die totipotent is: dit betekent dat de
cel nog alle soorten cellen kan vormen, inclusief extra-embryonale weefsels (zoals
placenta).
• Bij de blastocystfase differentiëren de cellen: de inner cell mass bevat pluripotente
stamcellen, die alle celtypes van het lichaam kunnen vormen, maar geen placenta
meer.
• Tijdens de verdere ontwikkeling (embryo → foetus → volwassene) differentiëren
stamcellen steeds verder naar multipotente stamcellen (zoals bloedstamcellen, die
alleen bloedcellen maken).
• Uiteindelijk ontstaan gespecialiseerde cellen (bv.
spiercel, zenuwcel, huidcel) die hun specifieke functies
uitvoeren.
ð Kortom: stamcellen verliezen gaandeweg hun “potentie”
(vermogen om celtypes te vormen): van totipotent →
pluripotent → multipotent → unipotent.
1. Totipotent
• Komt voor: direct na de bevruchting (zygote, eerste celdelingen).
• Eigenschap: kan uitgroeien tot alle celtypes, inclusief de extra-embryonale weefsels
(placenta).
• Voorbeeld: de bevruchte eicel en de eerste delingen.
2. Pluripotent
• Komt voor: in de blastocyst (binnenste celmassa).
• Eigenschap: kan uitgroeien tot alle celtypes van het lichaam, maar niet tot de placenta
→ dus geen volledige foetus alleen.
• Voorbeeld: embryonale stamcellen.
3. Multipotent
• Komt voor: verder in de ontwikkeling, in specifieke weefsels.
• Eigenschap: kan differentiëren tot meerdere celtypes binnen één weefsel of
orgaansysteem, maar niet tot alles.
• Voorbeeld: hematopoëtische stamcellen (maken rode bloedcellen, witte bloedcellen,
bloedplaatjes).
2
, à hESC’s= humane embryonale stamcellen
à het gebruik van embryonale stamcellen is ethisch gevoelig embryonale stamcellen
embryo’s vernietigen (wordt in België toegelaten onder strikte
voorwaarden)
à iPSC’s= Geïnduceerde pluripotente stamcellen
-> gemakkelijk om mee te werken
-> kunnen we zelfs organen mee maken
-> we halen die uit het lichaam (urine, bloed, fibroblasten uit de
huid) + we gaan transcriptiefactoren toevoegen (groen op figuur)
-> wachten -> cellen worden spontaan pluripotente stamcellen
1.4. kwaliteitscontrole
à als je met cellen werkt moet je altijd controles doen (met de
microscoop)
-> kijk of er in de cellen, in onze cultuur, geen schimmels of bacteriën aan het groeien zijn
à contaminatie micro-organismen: rijk groeimilieu bevat allerlei micro-organismen
zoals schimmels, mycoplasma’s (parasitair, moeilijke eliminatie, veranderen cellen)
à contaminatie vreemde cellen: helft van oudere cellijnen zijn varianten van HeLa, er
zijn er echter veel afkomstig van een muis → zuivere cellijn behouden moeilijk
1.5. Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit
à gemeten door karyogram: aantal en vorm chromosomen bepaald
à inherente genetische instabiliteit: genotype gecultiveerde cellen steeds slechter
-> beperken door terug te gaan naar stock-cultures
2. preparaten
(meer details zie nota’s)
1. Biopsie à paraffineblokje
à weefsel is veel te zacht om coupes te maken
à coupes om door een microscoop te kunnen kijken mogen niet dikker zij dan 5/1000
van mm
à weefsel hard maken door water in weefsel te vervangen door paraffine (vergelijkbaar
met kaarsvet: vloeibaar als je het opwarmt en het wordt hard als je het afkoelt)
Maken van paraffineblok:
1) biopsie komt van labo
2) Biopsies worden er via pincet uitgevist
3) Wordt op mousje gelegd in plastieken cassetje, hier wordt nog een mousje
opgelegd
4) Plastiekje casstje wordt afgesloten door metalen omhulsel
2. Paraffineblokje à ongekleurde coupe
à na het afkoelen haalt men dit eruit
à van deze paraffineblokjes kunnen we fijne coupes maken met een microtoom (een
zeer fijn mes)
3. Ongekleurde coupe à gekleurde coupe
à ongekleurde coupes worden losgemaakt van elkaar en worden aangebacht op
draagglaasje en blijven hierop kleven
à als je dit zo onder microsocoop legt zie je niks omdat dit zo dun is
à daarom wordt dit gekleurd door hematoxyline en eosine
3
, (Uit ongekleurde coupes kunnen we ook nog DNA en RNA extraheren)
4. Gekleurde coupe à microscopisch onderzoek
à beeld vergroot met microscoop
3. lichtmicroscopen
3.1. Overzicht:
à resolutie: 200 nm (bepaald door objectief en golflengte) = de kleinste afstand om 2 punten te
onderscheiden
à celculturen op dekglaasjes → behandeld met toto, dikmateriaal versneden, inbedding
paraffine
à gefixeerd en gekleurd → detectie met klaarveldmicroscoop
à levend en weinig contrast → speciale technieken
3.2. Klassieke licht- of klaarveldmicroscoop
à 3 lenzen: condensator, objectief en oculairen
à condensator: bundelt licht
à lichtbron: wit licht -> spiegel -> condensator -> preparaat -> projectie
retina -> prisma buigt licht
à meeste preparaten worden in een LM bekeken met wit licht, daarom
de naam Klaarveld-lichtmicroscoop
à objectief kijkt met korte, werkafstand naar preparaat
à PAS- kleuring= Periodic Acid Stuff
à HE-kleuring= hematoxyline-eosine
3.3. Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen
à fasecontrastmicroscopie
-> ongekleurd weefsel: verschillen in dichtheid -> beeldcontrast ?
-> breking licht -> faseverschuiving -> +/- interferentie -> beeld
à differentieel interferentie-contrasmicroscopie (DIC): gepolariseerd licht
à digitale microscopie: dynamisch (real time + time lapse)
à fluorescentiemicroscopen: life cell imaging
à verhoging contrast -> histologische kleuring reduceert amplitude
3.4. kleuringen
• Waarom?
à coupes hebben weinig contrast -> kleurstoffen nodig om structuren
zichtbaar te maken
à coupes worden eerst gedepraffineerd om de kleurstoffen te kunnen opnemen
• Belangrijkste kleuring: H/E (hematoxyline & eosine)
à hematoxyline: basische kleurstof, positief geladen -> bindt negatief geladen nucleïnezuren ->
kleurt celkernen blauw/ paars
à eosine: zure kleurstof, negatief geladen -> bindt positief geladen EW in cytoplasma -> kleurt
roze
à samen geven ze goed contrast tussen kern en cytoplasma; dit is de routinekleuring in
pathologie
• Specifieke kleuringen
à Indifferente kleurstoffen: kleuren vetten aan.
4
H1: prepareren en observeren van cellen en weefsels (kijk ook zeker naar notas)
1. doel: cellen en weefsels observeerbaar maken voor LM of EM
1.1. Celcultuur:
• Historiek:
à 3D weefselcultuur en 2D monolaagcultures, simuleren organen en weefsels
mbv orgaanexplanten (primair) in EMEM (Earle’s minimum essential medium)
à gebruik stabiele cellijnen met onbeperkte levensduur (tumoren of crisis)
à cultures → na x keren splitsen → veranderingen → sterven af → senescence
• stadia: tissue behandeld met enzymen → zakken/ centrifugatie = suspensie →
medium op petridish → primaire cultuur → confluente laag → secundaire
• condities
à MEM (minimal essential medium): isotone zouten (NaHCO3/H2CO3 buffer), energiebron,
essentiële aminozuren en vitamines, serum
à atmosfeer: 5% CO2 → goede pH = 7,4
• recipiënten: gesloten flessen, platen, rollerflessen, CO2 oven met cultuurplaten
• primaire culturen (eigen isolatie), andere labo’s, celbanken (vb ATTC)
1.2. groeisubstraten en procedures: doel in vivo = in vitro
• groeisubstraat: fysische drager + beschermt tegen anoikis (celdood), essentieel bij
adherente celculturen (buiten circulerende bloedcellen)
• materie: glas (-), coatings vb. poly-D-lysine, collageen (eiwit van ECM)
• signalen omliggende cellen nodig, nabootsen door medium (moedercultuur) of cellen op
feeder cellaag laten groeien
• vasthechting → beperkt celdood
• doel: adhesie, spreiding + interactie cellen of onderliggende en ECM (BM)
• cellen delen tot 2D monolaag → contactinhibitie van proliferatie
à herbeginnen? → nieuw medium of splitsen in dochterculturen
à tumoren: groeien in hoopjes door verlies contactinhibitie
• procedure celtransfer
à verdunning bij suspensieculturen
à adherente cellen → confluentie → behandeling trypsine / EDTA → cellen los
o magnocellulaire suspensie → verdunning
1
,1.3. stamcellen
= cel die vermogen heeft om zich voortdurend te delen en te differentiëren
(ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen/ weefsels
à 2 belangrijke eigenschappen:
1) het vermogen tot zelfvernieuwing, waarbij ze zichzelf delen en
kopieën van zichzelf maken
2) het vermogen om te differentiëren, waardoor de volwassen celtypen
ontstaan die onze organen en weefsels vormen
Proces:
• Na bevruchting (fertilisatie) ontstaat een zygote, die totipotent is: dit betekent dat de
cel nog alle soorten cellen kan vormen, inclusief extra-embryonale weefsels (zoals
placenta).
• Bij de blastocystfase differentiëren de cellen: de inner cell mass bevat pluripotente
stamcellen, die alle celtypes van het lichaam kunnen vormen, maar geen placenta
meer.
• Tijdens de verdere ontwikkeling (embryo → foetus → volwassene) differentiëren
stamcellen steeds verder naar multipotente stamcellen (zoals bloedstamcellen, die
alleen bloedcellen maken).
• Uiteindelijk ontstaan gespecialiseerde cellen (bv.
spiercel, zenuwcel, huidcel) die hun specifieke functies
uitvoeren.
ð Kortom: stamcellen verliezen gaandeweg hun “potentie”
(vermogen om celtypes te vormen): van totipotent →
pluripotent → multipotent → unipotent.
1. Totipotent
• Komt voor: direct na de bevruchting (zygote, eerste celdelingen).
• Eigenschap: kan uitgroeien tot alle celtypes, inclusief de extra-embryonale weefsels
(placenta).
• Voorbeeld: de bevruchte eicel en de eerste delingen.
2. Pluripotent
• Komt voor: in de blastocyst (binnenste celmassa).
• Eigenschap: kan uitgroeien tot alle celtypes van het lichaam, maar niet tot de placenta
→ dus geen volledige foetus alleen.
• Voorbeeld: embryonale stamcellen.
3. Multipotent
• Komt voor: verder in de ontwikkeling, in specifieke weefsels.
• Eigenschap: kan differentiëren tot meerdere celtypes binnen één weefsel of
orgaansysteem, maar niet tot alles.
• Voorbeeld: hematopoëtische stamcellen (maken rode bloedcellen, witte bloedcellen,
bloedplaatjes).
2
, à hESC’s= humane embryonale stamcellen
à het gebruik van embryonale stamcellen is ethisch gevoelig embryonale stamcellen
embryo’s vernietigen (wordt in België toegelaten onder strikte
voorwaarden)
à iPSC’s= Geïnduceerde pluripotente stamcellen
-> gemakkelijk om mee te werken
-> kunnen we zelfs organen mee maken
-> we halen die uit het lichaam (urine, bloed, fibroblasten uit de
huid) + we gaan transcriptiefactoren toevoegen (groen op figuur)
-> wachten -> cellen worden spontaan pluripotente stamcellen
1.4. kwaliteitscontrole
à als je met cellen werkt moet je altijd controles doen (met de
microscoop)
-> kijk of er in de cellen, in onze cultuur, geen schimmels of bacteriën aan het groeien zijn
à contaminatie micro-organismen: rijk groeimilieu bevat allerlei micro-organismen
zoals schimmels, mycoplasma’s (parasitair, moeilijke eliminatie, veranderen cellen)
à contaminatie vreemde cellen: helft van oudere cellijnen zijn varianten van HeLa, er
zijn er echter veel afkomstig van een muis → zuivere cellijn behouden moeilijk
1.5. Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit
à gemeten door karyogram: aantal en vorm chromosomen bepaald
à inherente genetische instabiliteit: genotype gecultiveerde cellen steeds slechter
-> beperken door terug te gaan naar stock-cultures
2. preparaten
(meer details zie nota’s)
1. Biopsie à paraffineblokje
à weefsel is veel te zacht om coupes te maken
à coupes om door een microscoop te kunnen kijken mogen niet dikker zij dan 5/1000
van mm
à weefsel hard maken door water in weefsel te vervangen door paraffine (vergelijkbaar
met kaarsvet: vloeibaar als je het opwarmt en het wordt hard als je het afkoelt)
Maken van paraffineblok:
1) biopsie komt van labo
2) Biopsies worden er via pincet uitgevist
3) Wordt op mousje gelegd in plastieken cassetje, hier wordt nog een mousje
opgelegd
4) Plastiekje casstje wordt afgesloten door metalen omhulsel
2. Paraffineblokje à ongekleurde coupe
à na het afkoelen haalt men dit eruit
à van deze paraffineblokjes kunnen we fijne coupes maken met een microtoom (een
zeer fijn mes)
3. Ongekleurde coupe à gekleurde coupe
à ongekleurde coupes worden losgemaakt van elkaar en worden aangebacht op
draagglaasje en blijven hierop kleven
à als je dit zo onder microsocoop legt zie je niks omdat dit zo dun is
à daarom wordt dit gekleurd door hematoxyline en eosine
3
, (Uit ongekleurde coupes kunnen we ook nog DNA en RNA extraheren)
4. Gekleurde coupe à microscopisch onderzoek
à beeld vergroot met microscoop
3. lichtmicroscopen
3.1. Overzicht:
à resolutie: 200 nm (bepaald door objectief en golflengte) = de kleinste afstand om 2 punten te
onderscheiden
à celculturen op dekglaasjes → behandeld met toto, dikmateriaal versneden, inbedding
paraffine
à gefixeerd en gekleurd → detectie met klaarveldmicroscoop
à levend en weinig contrast → speciale technieken
3.2. Klassieke licht- of klaarveldmicroscoop
à 3 lenzen: condensator, objectief en oculairen
à condensator: bundelt licht
à lichtbron: wit licht -> spiegel -> condensator -> preparaat -> projectie
retina -> prisma buigt licht
à meeste preparaten worden in een LM bekeken met wit licht, daarom
de naam Klaarveld-lichtmicroscoop
à objectief kijkt met korte, werkafstand naar preparaat
à PAS- kleuring= Periodic Acid Stuff
à HE-kleuring= hematoxyline-eosine
3.3. Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen
à fasecontrastmicroscopie
-> ongekleurd weefsel: verschillen in dichtheid -> beeldcontrast ?
-> breking licht -> faseverschuiving -> +/- interferentie -> beeld
à differentieel interferentie-contrasmicroscopie (DIC): gepolariseerd licht
à digitale microscopie: dynamisch (real time + time lapse)
à fluorescentiemicroscopen: life cell imaging
à verhoging contrast -> histologische kleuring reduceert amplitude
3.4. kleuringen
• Waarom?
à coupes hebben weinig contrast -> kleurstoffen nodig om structuren
zichtbaar te maken
à coupes worden eerst gedepraffineerd om de kleurstoffen te kunnen opnemen
• Belangrijkste kleuring: H/E (hematoxyline & eosine)
à hematoxyline: basische kleurstof, positief geladen -> bindt negatief geladen nucleïnezuren ->
kleurt celkernen blauw/ paars
à eosine: zure kleurstof, negatief geladen -> bindt positief geladen EW in cytoplasma -> kleurt
roze
à samen geven ze goed contrast tussen kern en cytoplasma; dit is de routinekleuring in
pathologie
• Specifieke kleuringen
à Indifferente kleurstoffen: kleuren vetten aan.
4
