Samenvatting – Inleiding histologie
Lichtmicroscopie van ingebedde coupes is de belangrijkste techniek in de histologie om
cel- en weefselstructuren te bestuderen. Omdat dierlijk weefsel zacht, weinig
contrastrijk en moeilijk snijdbaar is, moet het eerst gefixeerd, ingebed, gesneden en
gekleurd worden.
Bij de voorbereiding wordt het weefsel eerst gefixeerd om afbraak te stoppen en de
structuur zoveel mogelijk te behouden. Daarna wordt het gedehydrateerd via een
oplopende alcoholreeks, omdat paraffine niet mengbaar is met water. Vervolgens wordt
de alcohol vervangen door een intermedium zoals UltraClear, dat wel mengbaar is met
paraffine. Daarna kan het weefsel in gesmolten paraffine worden ingebed en tot een
stevig blokje stollen.
Met een microtoom worden vervolgens zeer dunne coupes gesneden, meestal van
ongeveer 2–8 μm. Deze worden op een voorwerpglaasje gebracht. Voor kleuring moet de
paraffine opnieuw verwijderd worden en wordt het preparaat weer gehydrateerd. Na het
kleuren volgt opnieuw ontwatering, waarna het preparaat in kunsthars wordt
gemonteerd en met een dekglaasje wordt afgesloten. Zo blijft het langdurig bewaard.
Paraffine-inbedding is een standaardmethode omdat ze goedkoop, eenvoudig en goed
automatiseerbaar is. Wanneer men vers, ongefixeerd weefsel wil onderzoeken, gebruikt
men vriescoupes.
Omdat cellen van nature kleurloos zijn, is kleuring noodzakelijk bij lichtmicroscopie.
Belangrijke kleurmethoden zijn:
• Hematoxyline-eosine (HE): kleurt celkernen paars/zwart en cytoplasma rood;
dit is de meest gebruikte routinekleuring.
, • Trichroom-methoden: gebruiken drie kleurstoffen om verschillende
weefselcomponenten, zoals steun- en spiervezels, te onderscheiden.
•
• PAS-kleuring: toont vooral koolhydraten aan, zoals glycogeen, glycoproteïnen
en basale membranen.
De laatste fase van de preparaatbereiding bestaat uit afwerken, etiketteren en
documenteren.
Samenvatting – Inbedden, snijden en kleuren
Bij het inbedden wordt het weefsel eerst in een bakje geplaatst en in 4% neutraal
gebufferde formol gefixeerd. Fixatie doodt het weefsel, stopt chemische processen en
bewaart de structuur. Omdat formol traag diffundeert, moet het weefsel ongeveer één
dag fixeren. Daarna wordt het overgebracht naar 70% alcohol. Te lang fixeren maakt het
weefsel te hard en moeilijk snijdbaar.
Daarna volgt de dehydratatie, omdat paraffine apolair is en dus niet mengbaar met
water. Het weefsel wordt daarom stap voor stap door oplopende alcoholconcentraties
gebracht: 70%, 90%, 95% en twee keer 100% ethanol of isopropanol. Vervolgens gaat
het twee keer in Ultraclear (UCl), dat zowel met alcohol als met paraffine mengbaar is.
Tijdens dit proces mag het weefsel niet uitdrogen, anders verandert de structuur.
Bij het echte inbedden in paraffine wordt het weefsel vanuit UCl overgebracht naar een
paraffine-oven van maximaal 64–65°C. Eerst gaat het in smeltkroesjes met paraffine,
waarbij het om het half uur wordt overgezet naar een volgend kroesje. Daarna wordt het
in een ijzeren bakje met vloeibare paraffine geplaatst, mooi gecentreerd en verder
overgoten met paraffine. Op een koud oppervlak begint de paraffine al te stollen zodat
het weefsel niet verschuift. Daarna wordt het blokje snel afgekoeld in de koelkast.
, Met de microtoom worden vervolgens dunne coupes van ongeveer 5 tot 8 μm
gesneden. Vooraf wordt een warmwaterbad klaargemaakt op ongeveer 48–49°C met
toevoeging van stick-on, zodat de coupes zich mooi strekken en later goed op het
draagglaasje blijven kleven. Gekoelde blokjes snijden beter. Eerst worden dikkere
coupes gemaakt om het juiste vlak te bereiken, daarna dunnere.
Bij het snijden kunnen problemen optreden, zoals compressie, trillen van het mes,
slechte ribben of oprollen van sneden. Oplossingen zijn onder andere: blokje
afkoelen, mes correct plaatsen en vastzetten, trager en soepeler snijden, en de
temperatuur van warmwaterbad of oven controleren. Ook te snel draaien of een te warm
mes veroorzaakt rimpelingen.
Na het snijden worden de coupes uit het waterbad met een draagglaasje opgevist.
Daarna laat men ze drogen, markeert men ze en worden ze minstens 30 minuten bij
60°C verder gedroogd of “gebakken”. Daarna wordt alles opgeruimd: mes en blokje
verwijderen, microtoom reinigen en warmwaterschaal leegmaken.
Voor het kleuren moeten de coupes eerst gedeparaffineerd en gehydrateerd worden,
omdat kleurstoffen wateroplosbaar zijn. Dat gebeurt in omgekeerde volgorde van de
dehydratatie: van UCl via alcoholreeksen naar water. Daarna worden de coupes
individueel gekleurd met een geschikte kleuring, afhankelijk van welke structuren men
zichtbaar wil maken.
Na de kleuring volgt opnieuw dehydratatie, zodat het preparaat kan worden bewaard.
Vervolgens wordt het preparaat gemonteerd met hars en afgedekt met een dekglaasje.
Dit moet voorzichtig gebeuren om luchtbellen te vermijden. Tot slot is een nauwkeurige
recuperatie en afwerking van het preparaat belangrijk.
Lichtmicroscopie van ingebedde coupes is de belangrijkste techniek in de histologie om
cel- en weefselstructuren te bestuderen. Omdat dierlijk weefsel zacht, weinig
contrastrijk en moeilijk snijdbaar is, moet het eerst gefixeerd, ingebed, gesneden en
gekleurd worden.
Bij de voorbereiding wordt het weefsel eerst gefixeerd om afbraak te stoppen en de
structuur zoveel mogelijk te behouden. Daarna wordt het gedehydrateerd via een
oplopende alcoholreeks, omdat paraffine niet mengbaar is met water. Vervolgens wordt
de alcohol vervangen door een intermedium zoals UltraClear, dat wel mengbaar is met
paraffine. Daarna kan het weefsel in gesmolten paraffine worden ingebed en tot een
stevig blokje stollen.
Met een microtoom worden vervolgens zeer dunne coupes gesneden, meestal van
ongeveer 2–8 μm. Deze worden op een voorwerpglaasje gebracht. Voor kleuring moet de
paraffine opnieuw verwijderd worden en wordt het preparaat weer gehydrateerd. Na het
kleuren volgt opnieuw ontwatering, waarna het preparaat in kunsthars wordt
gemonteerd en met een dekglaasje wordt afgesloten. Zo blijft het langdurig bewaard.
Paraffine-inbedding is een standaardmethode omdat ze goedkoop, eenvoudig en goed
automatiseerbaar is. Wanneer men vers, ongefixeerd weefsel wil onderzoeken, gebruikt
men vriescoupes.
Omdat cellen van nature kleurloos zijn, is kleuring noodzakelijk bij lichtmicroscopie.
Belangrijke kleurmethoden zijn:
• Hematoxyline-eosine (HE): kleurt celkernen paars/zwart en cytoplasma rood;
dit is de meest gebruikte routinekleuring.
, • Trichroom-methoden: gebruiken drie kleurstoffen om verschillende
weefselcomponenten, zoals steun- en spiervezels, te onderscheiden.
•
• PAS-kleuring: toont vooral koolhydraten aan, zoals glycogeen, glycoproteïnen
en basale membranen.
De laatste fase van de preparaatbereiding bestaat uit afwerken, etiketteren en
documenteren.
Samenvatting – Inbedden, snijden en kleuren
Bij het inbedden wordt het weefsel eerst in een bakje geplaatst en in 4% neutraal
gebufferde formol gefixeerd. Fixatie doodt het weefsel, stopt chemische processen en
bewaart de structuur. Omdat formol traag diffundeert, moet het weefsel ongeveer één
dag fixeren. Daarna wordt het overgebracht naar 70% alcohol. Te lang fixeren maakt het
weefsel te hard en moeilijk snijdbaar.
Daarna volgt de dehydratatie, omdat paraffine apolair is en dus niet mengbaar met
water. Het weefsel wordt daarom stap voor stap door oplopende alcoholconcentraties
gebracht: 70%, 90%, 95% en twee keer 100% ethanol of isopropanol. Vervolgens gaat
het twee keer in Ultraclear (UCl), dat zowel met alcohol als met paraffine mengbaar is.
Tijdens dit proces mag het weefsel niet uitdrogen, anders verandert de structuur.
Bij het echte inbedden in paraffine wordt het weefsel vanuit UCl overgebracht naar een
paraffine-oven van maximaal 64–65°C. Eerst gaat het in smeltkroesjes met paraffine,
waarbij het om het half uur wordt overgezet naar een volgend kroesje. Daarna wordt het
in een ijzeren bakje met vloeibare paraffine geplaatst, mooi gecentreerd en verder
overgoten met paraffine. Op een koud oppervlak begint de paraffine al te stollen zodat
het weefsel niet verschuift. Daarna wordt het blokje snel afgekoeld in de koelkast.
, Met de microtoom worden vervolgens dunne coupes van ongeveer 5 tot 8 μm
gesneden. Vooraf wordt een warmwaterbad klaargemaakt op ongeveer 48–49°C met
toevoeging van stick-on, zodat de coupes zich mooi strekken en later goed op het
draagglaasje blijven kleven. Gekoelde blokjes snijden beter. Eerst worden dikkere
coupes gemaakt om het juiste vlak te bereiken, daarna dunnere.
Bij het snijden kunnen problemen optreden, zoals compressie, trillen van het mes,
slechte ribben of oprollen van sneden. Oplossingen zijn onder andere: blokje
afkoelen, mes correct plaatsen en vastzetten, trager en soepeler snijden, en de
temperatuur van warmwaterbad of oven controleren. Ook te snel draaien of een te warm
mes veroorzaakt rimpelingen.
Na het snijden worden de coupes uit het waterbad met een draagglaasje opgevist.
Daarna laat men ze drogen, markeert men ze en worden ze minstens 30 minuten bij
60°C verder gedroogd of “gebakken”. Daarna wordt alles opgeruimd: mes en blokje
verwijderen, microtoom reinigen en warmwaterschaal leegmaken.
Voor het kleuren moeten de coupes eerst gedeparaffineerd en gehydrateerd worden,
omdat kleurstoffen wateroplosbaar zijn. Dat gebeurt in omgekeerde volgorde van de
dehydratatie: van UCl via alcoholreeksen naar water. Daarna worden de coupes
individueel gekleurd met een geschikte kleuring, afhankelijk van welke structuren men
zichtbaar wil maken.
Na de kleuring volgt opnieuw dehydratatie, zodat het preparaat kan worden bewaard.
Vervolgens wordt het preparaat gemonteerd met hars en afgedekt met een dekglaasje.
Dit moet voorzichtig gebeuren om luchtbellen te vermijden. Tot slot is een nauwkeurige
recuperatie en afwerking van het preparaat belangrijk.
