Voorbereiding test 1 Labo Biotechnologie (alle principes tot nu toe)
1. Principe Preparatieve agarosegel EF
Wat is het?
• Scheidingstechniek voor nucleïnezuren (NA)
• Gebruikt agarose gelmatrix
• Elektroforese voor migratie
• Voorbereiding voor verdere toepassingen
De migratiesnelheid is afhankelijk van?
1. de DNA conformatie: lineaire, open circulaire en supercoiled DNA moleculen met eenzelfde
grootte (# bp) migreren met een verschillende snelheid. De mobiliteit (µ) van supercoiled
DNA is groter dan deze van lineair DNA, welke op zijn beurt groter is dan de mobiliteit van
open cirkel DNA.
2. de grootte van de DNA molecule: voor lineaire DNA moleculen geldt µ= 1/ log aantal bp.
3. de concentratie agarose in de gel: hoe groter de concentratie hoe kleiner de mobiliteit van
DNA moleculen.
4. de aangelegde spanning: bij relatief lage veldsterkte is de mobiliteit van lineair DNA
evenredig met de veldsterkte. De resolutie is optimaal bij veldsterktes van 5 à 10 V per cm.
Hoe werkt het?
• Gel en buffer maken en laden
• Monstermengsel laden op gel
• Voedingsbron aanleggen → beweging
• Visualiseren (en band uitsnijden)
GelRed is een voorbeeld
• Gebruik voor verdere toepassing
Bv. Zuivering PCR product, klonering, sequentiebepaling of oligonucleotide-synthese
Variabelen
• DNA conformatie + grootte
• % agarose (scheidend vermogen)
Als concentratie↑ → migratiesnelheid↓
• Spanning
Te hoog: oververhitting → smelten gel, degradatie monster en slechte resolutie
Te laag: te trage migratie → langere looptijden en slechtere scheiding
• Tijd
Te lang: overmatige migratie → onmogelijkheid tot fragmentidentificatie
Te kort: onvoldoende scheiding → fragmentidentificatie vermoeilijkt/onmogelijk
2. Opzuiveren DNA fragment uit agarosegel
Stappenplan
• Gel oplossen in Gel Solubilization Buffer + warmte (50°C)
• Isopropanol toevoegen → betere DNA-zuivering
• L3 buffer → Guanidine Isothiocyanaat
, Denaturatie van DNase, DNA komt vrij
• DNA bindt aan silicamembraan van de kolom
lineair
40bp – 10 kb
max 15 µg
Silica heeft een hoge affiniteit voor nucleïnezuren, zoals DNA, vanwege de
elektrostatische interacties tussen de negatief geladen fosfaatgroepen in het DNA
en de positief geladen silicadeeltjes.
• Wasstap met ethanol → onzuiverheden volledig verwijderen
• Elueren met Tris/HCl (pH 8,5) → stabiliteit tijdens het elueren
3. Principe fluorimetrie
Wat is het?
• DNA concentratie bepaling
• sdDNA
• NIET ssDNA of andere verontreinigingen (RNA, eiwitten, zouten …)
Hoe?
• Elektron absorbeert lichtenergie van specifieke golflengtes (foton)
• Excitatie van grondtoestand naar aangeslagen toestand
• Korte instabiele toestand
• Terugval naar grondtoestand
• Emissie van lichtenergie met langere golflengte (minder energie)
Interpretatie resultaat
• Fluorescentie-intensiteit ~ DNA-concentratie
• Hogere fluorescentie-intensiteit → hogere DNAconcentratie
• Lagere fluorescentie-intensiteit → lagere DNA-concentratie
• Excitatie- en emissiegolflengten afhankelijk van fluorescerende eigenschappen moleculen
• Standaardcurve
Voordelen
• DNA specifiek → Kleine kans binding ssDNA en RNA
• Snel
• Nauwkeurig, exact
• Gevoelig → Detectie kleine hoeveelheden mogelijk
• Specifieke detectie DNA
• Specifieke kleurstof voor dsDNA
Nadeel
• Zuiverheid?
1. Principe Preparatieve agarosegel EF
Wat is het?
• Scheidingstechniek voor nucleïnezuren (NA)
• Gebruikt agarose gelmatrix
• Elektroforese voor migratie
• Voorbereiding voor verdere toepassingen
De migratiesnelheid is afhankelijk van?
1. de DNA conformatie: lineaire, open circulaire en supercoiled DNA moleculen met eenzelfde
grootte (# bp) migreren met een verschillende snelheid. De mobiliteit (µ) van supercoiled
DNA is groter dan deze van lineair DNA, welke op zijn beurt groter is dan de mobiliteit van
open cirkel DNA.
2. de grootte van de DNA molecule: voor lineaire DNA moleculen geldt µ= 1/ log aantal bp.
3. de concentratie agarose in de gel: hoe groter de concentratie hoe kleiner de mobiliteit van
DNA moleculen.
4. de aangelegde spanning: bij relatief lage veldsterkte is de mobiliteit van lineair DNA
evenredig met de veldsterkte. De resolutie is optimaal bij veldsterktes van 5 à 10 V per cm.
Hoe werkt het?
• Gel en buffer maken en laden
• Monstermengsel laden op gel
• Voedingsbron aanleggen → beweging
• Visualiseren (en band uitsnijden)
GelRed is een voorbeeld
• Gebruik voor verdere toepassing
Bv. Zuivering PCR product, klonering, sequentiebepaling of oligonucleotide-synthese
Variabelen
• DNA conformatie + grootte
• % agarose (scheidend vermogen)
Als concentratie↑ → migratiesnelheid↓
• Spanning
Te hoog: oververhitting → smelten gel, degradatie monster en slechte resolutie
Te laag: te trage migratie → langere looptijden en slechtere scheiding
• Tijd
Te lang: overmatige migratie → onmogelijkheid tot fragmentidentificatie
Te kort: onvoldoende scheiding → fragmentidentificatie vermoeilijkt/onmogelijk
2. Opzuiveren DNA fragment uit agarosegel
Stappenplan
• Gel oplossen in Gel Solubilization Buffer + warmte (50°C)
• Isopropanol toevoegen → betere DNA-zuivering
• L3 buffer → Guanidine Isothiocyanaat
, Denaturatie van DNase, DNA komt vrij
• DNA bindt aan silicamembraan van de kolom
lineair
40bp – 10 kb
max 15 µg
Silica heeft een hoge affiniteit voor nucleïnezuren, zoals DNA, vanwege de
elektrostatische interacties tussen de negatief geladen fosfaatgroepen in het DNA
en de positief geladen silicadeeltjes.
• Wasstap met ethanol → onzuiverheden volledig verwijderen
• Elueren met Tris/HCl (pH 8,5) → stabiliteit tijdens het elueren
3. Principe fluorimetrie
Wat is het?
• DNA concentratie bepaling
• sdDNA
• NIET ssDNA of andere verontreinigingen (RNA, eiwitten, zouten …)
Hoe?
• Elektron absorbeert lichtenergie van specifieke golflengtes (foton)
• Excitatie van grondtoestand naar aangeslagen toestand
• Korte instabiele toestand
• Terugval naar grondtoestand
• Emissie van lichtenergie met langere golflengte (minder energie)
Interpretatie resultaat
• Fluorescentie-intensiteit ~ DNA-concentratie
• Hogere fluorescentie-intensiteit → hogere DNAconcentratie
• Lagere fluorescentie-intensiteit → lagere DNA-concentratie
• Excitatie- en emissiegolflengten afhankelijk van fluorescerende eigenschappen moleculen
• Standaardcurve
Voordelen
• DNA specifiek → Kleine kans binding ssDNA en RNA
• Snel
• Nauwkeurig, exact
• Gevoelig → Detectie kleine hoeveelheden mogelijk
• Specifieke detectie DNA
• Specifieke kleurstof voor dsDNA
Nadeel
• Zuiverheid?
