VOLLEDIGE Samenvatting Methoden 3 (3de BMW)

Samenvatting Methoden 3 ( Januari)

Hoofdstuk 2: Analyse van DNA en Genomics

1. DNA Sequentiebepaling
First generation sequencing: Sanger
-​ Kloneren, elektroforese (scheiding van fragmenten op grootte)
-​ Veel gebruikt voor kleine projecten


Second generation sequencing: NGS (Next Generation Sequencing)
-​ Gebaseerd op short read (30-100 bp)
-​ Met alle sequencen puzzelen we een volledig humaan genoom
-​ Illumina, ion Torrent


Third Generation sequencing: Next-next generation Sequencing
-​ Kijken naar hele lang fragmenten van DNA (duizenden, miljoenen bp)
-​ Belangrijk bij een repetitieve sequentie om daardoor te lezen
-​ Individuele moleculen gaan sequencing
-​ Geen amplificatie
-​ Nanopore, PacBio




Brede toepassingen
1.​ Novo Genoom Sequentie bepaling: ongekende genomen worden gesequenced
2.​ Requencing: individuen vergelijken met een referentiegenoom. Kijken wat er fout is,
bepalen of er SNPs zijn, mutaties identificeren, farmacogenetica (hoe snel wordt een
medicijn gemetaboliseerd)
3.​ Sequentiebepaling als teller: kijken hoeveel sequenties er aanwezig zijn in de mix




Novo Genoom Sequentie Bepaling: Volledige genoom bepalen (WHOLE GENOME
SEQUENCING)
-​ DNA wordt in stukjes gebroken en van alle stukjes wordt de sequentie bepaald →
Daarna wordt alles naast elkaar gelegd (kijken naar welke volgorde van sequenties)
-​ Vorming van het referentiegenoom




1

,Requencing: Genoom van individu wordt vergelijken met referentiegenoom
-​ Kijken naar SNP of mutaties


Als men kijkt naar een kankergenoom
-​ Tumoren zijn vaak ontstaan door coderende mutaties (in exonen) → Niet veel zin om
het volledige genoom na te kijken
-​ → Whole Exon Sequencing (WES) doen = enkel naar exonen (coderende
sequenties) kijken → Kostprijs ligt ook veel lager


Kijken naar een mutatie die ligt op het X-Chromosoom
-​ Kijken naar een specifiek deel in het genoom = Targeted Sequencing




1.1 Eerste Generatie Sequentiebepaling

Chemisch klieving methode: niet kennen voor examen


Sanger Sequencing = Nieuw Synthese met dideoxy-keten
-​ Nodig: DNA polymerase, amplicon, primer, dNTP, ddATP
-​ De zuurstof die aanwezig is op DNA suikergroep (bij dNTP) = vormt het
aanhechtingspunt voor een andere nucleotide → Vorming van DNA Streng
-​ ddNTP bevat geen zuurstof → Geen ketenvorming → Reactie gaat stoppen




Eerst radioactief labelen → Daarna fluorescent maken
-​ Verschillende fluorescente labels gebruiken
voor de verschillende lengten van fragmenten
-​ Naargelang de grootte van het DNA fragment:
ander fluorescent signaal
-​ → Hiermee de sequentie bepalen




Normale dNTP: bevat OH groep op C3
ddNTP: bevat geen OH groep op C3
-​ De OH groep gaat fosfodiester verbindingen vormen in de DNA keten



2

, Template = Gefragmenteerde genoom dat geamplificeerd wordt door
kloneren of een specifiek fragment dat geamplificeerd wordt met PCR
Polymerasen zijn thermostabiel en kunnen dNTPs en ddNTPs
inbouwen


Capillaire gelelektroforese: Kleine fragmentjes komen voorbij de
sensor en worden afgelezen
-​ Langste fragmentje wordt als laatste afgelezen
-​ Links - Rechts = Klein - Groot
-​ In beeld brengen via elektroferogram (Eerste 20-30
basenparen zijn moeilijk om af te lezen → Signaal is te sterk en het is moeilijk om te
onderscheiden welke base het is)


Per base: Phred Score (probabiliteit) toegekend over hoe zeker je bent dat de base juist is
dat je afleest
-​ Score is 10 → 1 op 10 is er een foute base




Mutatie detectie

Bij mutant: Lezen twee basen af
-​ Hoe komt dit? Door heterozygote SNP (beide allelen hebben op die positie een
verschillend nucleotide en de sequentie-reactie geeft van beide allelen signalen)
-​ Komt door een insertie, deletie in 1 van de twee allelen (1 allel heeft een extra base tov
de andere allel)




Humaan ●​ Bloed wordt afgestaan van verschillende individuen en daarna wordt dit
Genoom Project gesequenced
(HGP) ●​ Methode die gebruikt wordt voor HGP: Hierarchical Shotgun Sequencing met
Sanger Methode


●​ YAC = je kan grote stukken DNA (2 miljoen basenparen) in stoppen




3

, ●​ DNA wordt doorgegeven: kloneren van YAC en dat komt vervolgens in BAC, en
verder


●​ De DNA fragmenten worden gekloneerd in de YAC, BAC, P1s, Cosmiden
●​ Cosmiden = kleinste, wordt uiteindelijk gesequendeerd


●​ Het heeft 5 jaar geduurd om de fragmenten in YAC, BAC, P1, cosmiden te stoppen
(mapping en fragmentation)
●​ Ieder groot kloon (bijv. een BAC) wordt apart verkleind in random kleine
stukken (1–2 kb).


●​ Die kleine stukken worden gekloneerd en gesequenced met de Sanger-methode.
●​ De stalen werden verdeeld over labo’s die deelnemen aan HGP en daar
werden de DNA sequenties afgelezen (100-den toestellen werden op hetzelfde
moment gebruikt over heel de wereld)


●​ Open science: elke 24u werden er sequenties vrijgegeven
●​ Data werd ter beschikking gesteld in databanken (NCBI / Ensemble / UCSC)



HGP door Celera ●​ Methode = Whole genome Shotgun Sequencing: random cloning en geen mapping
Genomics ●​ Het genoom werd in kleine stukjes verdeeld en achteraf heeft hij de
verschillende stukjes aan elkaar geplakt




Enorme impact op
1.​ Technologische ontwikkeling van sequencing: automatisering, aanpak
2.​ Grote ontwikkeling in bio-informatica (stijging in sequentie data)
3.​ Open Science en Open data
4.​ Biologische kennis: vergelijken van normale sequentie en op zoek gaan naar
mutaties in die genen
5.​ Genomics: kijken hoeveel groepen genetisch verschillen van elkaar (evolutie)
6.​ Van telomeer tot telomeer lezen




→ Mogelijkheden van Personalized Precision Medicine
-​ Weten wat de kans is dat er bepaalde complicaties / aandoeningen zich gaan
ontwikkelen



4