Medische genetica:
0.Inleiding:
0.1. geschiedenis medische genetica:
▪ 1990: Humaan Genoom Project
Initiatief v.d. NIH en Dept of Energy in de VSA
Verschillende laboratoria wereldwijd
- Academische wereld
- Industrie
- Niet-commerciële organisaties
Doelstelling: ontrafeling van menselijk genoom in 15 jaar
- Identificatie van alle genen
- Sequentiebepaling van 3 miljard nucleotiden
- Budget: 3 miljard dollar
DNA lezen = sequentiebepaling → opvolging van basen
▪ ‘The thousand dollar genome’
Van ‘human’ naar ‘personal’ genome project
Heel duur
▪ Huidige uitdagingen in medische genetica:
Revolutie #1: Human genome project (2001)
Revolutie #2: Next generation sequencing (2007)
Uitdaging #1: interpretatie van de
niet-coderende delen van het genoom
Uitdaging #2: nood aan “single
molecule genome sequencing”
Uitdaging #3: nood aan meer
netwerking
0.2. Het menselijk genoom:
▪ Mitochondriaal genoom
▪ Nucleair genoom (haploid)
23 verschillende chromosomen
Ongeveer 22 000 genen
3 miljard (basen)
1
, ▪ DNA:
→ 2 polynucleotideketens in tegenovergestelde richting vormen een dubbele helix
Maximale condensatie: DNA streng is gereduceerd naar ongeveer 1/10 000 van zijn
oorspronkelijke lengte
Genen liggen op chromosomen
- Genen zitten er gewoon en doen niets
- Mutaties maken niet ziek → veel onschuldige,
meeste gaan niets doen
- Wat bepaald ziekte:
→ Expressie v.h. gen → het eiwit (doet
job op lichaamsniveau)
→ Veranderd het gen iets aan eiwit → overschrijving naar eiwit
Centrale dogma van moleculaire biologie
1. Mutatiedetectie technieken
▪ Kern aspecten van elke techniek
▪ Weten welke techniek gebruiken om welke mutatie op te sporen
▪ Voor en nadelen van technieken
1.0. inleiding
Erfelijke aandoeningen worden veroorzaakt door verschillende afwijkingen op DNA niveau
- Gaat van numerieke of grote structurele chromosoomafwijkingen tot puntmutaties
- Voor elke detectie van afwijkingen zijn tal van cytogenetische en moleculaire technieken
beschikbaar
- Elk van deze technieken heeft voordelen en beperkingen
- Welke techniek aangewezen is voor detectie v.e. onderliggend genetisch defect is dan ook
afhankelijk van onderliggend mutatiemechanisme of aard van afwijking
1.1. cytogenetische technieken
Cytogenetica omvat de studie van chromosomen en de afwijkingen hieraan
De belangrijkste cytogenetische onderzoeken zijn het conventioneel chromosomenonderzoek en de
fluorescente in situ hybridisatie (FISH).
1.1.2. conventioneel chromosomenonderzoek
2
,→ doel: opstellen van chromosomenkaart/karyogram
- Hierdoor numerieke en grote structurele (>5Mb) afwijkingen van chromosomen vastgesteld
worden
- Praktische resolutie (kleinst waarneembare afwijking) v.e. karyogram is echter afhankelijk van
kwaliteit + kan verschillen van karyogram tot karyogram
- Hoe lager kwaliteit, hoe lager de resolutie
Verschillende stappen aanmaak karyogram:
1) Celcultuur:
▪ Vertrokken vanuit delende cellen, voor opsporen van constitutionele aandoeningen
wordt meestal perifeer bloed afgenomen (T-lymfocyten), verworden afwijkingen
opgespoord worden in tumorcellen of beenmergcellen
▪ Deze cellen worden gedurende bepaalde periode in cultuur gezet in specifiek
kweekmedium aangevuld met groeifactoren of mitogenen
▪ Dankzij aanwezigheid mitogeen worden cellen aangezet tot deling
2) Oogsten:
▪ Tijdens celcyclus doorlopen cellen verschillende fases waarin erfelijk materiaal wordt
verdubbeld en verdeeld over 2 dochtercellen
▪ Tijdens mitose condenseren chromosomen zodat ze zichtbaar worden onder
lichtmicroscoop
▪ In metafase bevinden chromosomen zich in meest gecondenseerde staat en dis is dus
ideale fase om chromosomen te visualiseren voor opstellen v.e. karyogram
▪ Daarom wordt celdeling na aantal dagen cultuur gestopt in metafasestadium door
toevoeging van colcemide → inhibeert vorming v.d. mitotische spoelfiguur, waardoor
cellen niet voorbij metafase geeraken
▪ Vervolgens wordt een hypotone oplossing toegevoegd waardoor cel opzwelt zodat
chromosomen meer plaats krijgen om spreiden + celwand meer gespannen staat
▪ Daarna worden cellen in opgeblazen toestand gefixeerd door toeboegingn van fixatief
bestaande uit methanol + azijnzuur
▪ Dit fixatief verwijdert water uit cellen, doodt en bewaart cellen, verhardt het
membraan en het chromatine → hierdoor is kleuring van chromosomen mogelijk
3) Spreiden:
▪ Na fixatie worden geoogste cellen op objectglaasjes gedruppeld en onder specifieke
omstandigheden gedroogd → optimale spreiding van chromosomen te bekomen
4) Kleuring:
▪ Na differentiële kleuring kunnen constitutionele
chromosomale afwijkingen (numerieke en structurele
afwijkingen) worden opgespoord
▪ Door kleuring wordt bandenpatroon verkregen dat specifiek
is voor elk chromosoom
▪ Chromosoombanden worden genummerd vertrekkend vanaf
het centromeer tot aan het telomeer → per chromosoomarm
(korte arm = p-arm ; lange arm = q-arm)
▪ Locatie v.e. afwijking aan chromosoom kan hierdoor precies
beschreven worden
▪ Verschillende kleuringsmethodes:
3
, - Quinacrine-bandering (Q-bandering): eerste kleuringsmethode, gebruik
maken van quinacrine voor het bekomen van specifieke bandenpatronen,
wordt niet meer vaak gebruik vermits fluorescentiemicroscoop nodig
- Giemsa-bandering (G-bandering): meest gebruikte methode, hierbij
chromosomen eerst getrypsiniseer waarna Giemsa kleurstof wordt toegevoegd
- Reverse-bandering (R-bandering): wanneer chromosomen voor de kleuring
verhit worden, vertonen chromosomen een bandering die omgekeerd is aan
het bandenpatroon gegenereerd met Q-of G- bandering, vandaar de naam
- Ook nog andere kleuringstechnieken specifiek voor bepaalde delen van
chromosomen
5) Metafasen selecteren onder lichtmicroscoop:
▪ Metafasen onder lichtmiscroscoop (1000x vergroting) geteld en geanalyseerd worden
▪ Bij constitutionele indicaties minstens 2 metafasen onderzocht, bij verworven
aandoeningen standaard minstens 20 metafasen geanalyseerd
▪ Chromosomenkaarten kunnen vervolgens door computer gestuurde beeldanalyse
opgesteld worden
6) Het karyogram:
▪ Bij het opstellen van karyogram worden chromsomen eerst gesorteerd op grootte en
nadien volgens centromeerpositie
▪ Humane chromosomen geranschikt in 3 subtypes
volgens positie centromeer:
- Metacentrische chromosomen waarbij p en
q-armen ongeveer even groot zijn +
centromeer centraal ligt (chromosomen 1-
3)
- Submetacentrische chromosomen (4-12 en
16-20) waarbij p-arm korter is
- Acrocentrische chromosomen waarbij er
quasi geen p-arm is (13-15 en 21-22)
▪ Normaal karyogram bevat 22 paar autosomen en 2
geslachtschromosomen
▪ Genoteerd als karyotype: 46,XX (vrouw) en 46,XY (man)
▪ Bij analyse van karyogram wordt nagekeken of er numerieke of structurele
afwijkingen aanwezig zijn
▪ Bij numerieke afwijkingen noteert men aantal chromosomen en chromosoom dat te
vee of te weinig is, voorafgegaan door respectievelijke +/- (vb. 47,XX,+21)
▪ Ook structurele afwijkingen: deze worden onderverdeeld in gebalanceerde en
ongebalanceerde afwijkingen
- Gebalanceerde afwijkingen: geen netto verlies of winst van chromosomaal
materiaal
- Ongebalanceerde afwijkingen: wel verlies of winst chromosomaal materiaal
Belangrijkste gebalanceerde afwijkingen die aangetoond kunnen worden met karyotypering:
• Reciproke translocaties: chromosoomsegmenten uitgewisseld tussen 2 chromosomen, zonder
wijziging aantal chromosomen
→ notatie: t(chr1;chr2)(breukpuntchr1;breukpuntchr2)
4
0.Inleiding:
0.1. geschiedenis medische genetica:
▪ 1990: Humaan Genoom Project
Initiatief v.d. NIH en Dept of Energy in de VSA
Verschillende laboratoria wereldwijd
- Academische wereld
- Industrie
- Niet-commerciële organisaties
Doelstelling: ontrafeling van menselijk genoom in 15 jaar
- Identificatie van alle genen
- Sequentiebepaling van 3 miljard nucleotiden
- Budget: 3 miljard dollar
DNA lezen = sequentiebepaling → opvolging van basen
▪ ‘The thousand dollar genome’
Van ‘human’ naar ‘personal’ genome project
Heel duur
▪ Huidige uitdagingen in medische genetica:
Revolutie #1: Human genome project (2001)
Revolutie #2: Next generation sequencing (2007)
Uitdaging #1: interpretatie van de
niet-coderende delen van het genoom
Uitdaging #2: nood aan “single
molecule genome sequencing”
Uitdaging #3: nood aan meer
netwerking
0.2. Het menselijk genoom:
▪ Mitochondriaal genoom
▪ Nucleair genoom (haploid)
23 verschillende chromosomen
Ongeveer 22 000 genen
3 miljard (basen)
1
, ▪ DNA:
→ 2 polynucleotideketens in tegenovergestelde richting vormen een dubbele helix
Maximale condensatie: DNA streng is gereduceerd naar ongeveer 1/10 000 van zijn
oorspronkelijke lengte
Genen liggen op chromosomen
- Genen zitten er gewoon en doen niets
- Mutaties maken niet ziek → veel onschuldige,
meeste gaan niets doen
- Wat bepaald ziekte:
→ Expressie v.h. gen → het eiwit (doet
job op lichaamsniveau)
→ Veranderd het gen iets aan eiwit → overschrijving naar eiwit
Centrale dogma van moleculaire biologie
1. Mutatiedetectie technieken
▪ Kern aspecten van elke techniek
▪ Weten welke techniek gebruiken om welke mutatie op te sporen
▪ Voor en nadelen van technieken
1.0. inleiding
Erfelijke aandoeningen worden veroorzaakt door verschillende afwijkingen op DNA niveau
- Gaat van numerieke of grote structurele chromosoomafwijkingen tot puntmutaties
- Voor elke detectie van afwijkingen zijn tal van cytogenetische en moleculaire technieken
beschikbaar
- Elk van deze technieken heeft voordelen en beperkingen
- Welke techniek aangewezen is voor detectie v.e. onderliggend genetisch defect is dan ook
afhankelijk van onderliggend mutatiemechanisme of aard van afwijking
1.1. cytogenetische technieken
Cytogenetica omvat de studie van chromosomen en de afwijkingen hieraan
De belangrijkste cytogenetische onderzoeken zijn het conventioneel chromosomenonderzoek en de
fluorescente in situ hybridisatie (FISH).
1.1.2. conventioneel chromosomenonderzoek
2
,→ doel: opstellen van chromosomenkaart/karyogram
- Hierdoor numerieke en grote structurele (>5Mb) afwijkingen van chromosomen vastgesteld
worden
- Praktische resolutie (kleinst waarneembare afwijking) v.e. karyogram is echter afhankelijk van
kwaliteit + kan verschillen van karyogram tot karyogram
- Hoe lager kwaliteit, hoe lager de resolutie
Verschillende stappen aanmaak karyogram:
1) Celcultuur:
▪ Vertrokken vanuit delende cellen, voor opsporen van constitutionele aandoeningen
wordt meestal perifeer bloed afgenomen (T-lymfocyten), verworden afwijkingen
opgespoord worden in tumorcellen of beenmergcellen
▪ Deze cellen worden gedurende bepaalde periode in cultuur gezet in specifiek
kweekmedium aangevuld met groeifactoren of mitogenen
▪ Dankzij aanwezigheid mitogeen worden cellen aangezet tot deling
2) Oogsten:
▪ Tijdens celcyclus doorlopen cellen verschillende fases waarin erfelijk materiaal wordt
verdubbeld en verdeeld over 2 dochtercellen
▪ Tijdens mitose condenseren chromosomen zodat ze zichtbaar worden onder
lichtmicroscoop
▪ In metafase bevinden chromosomen zich in meest gecondenseerde staat en dis is dus
ideale fase om chromosomen te visualiseren voor opstellen v.e. karyogram
▪ Daarom wordt celdeling na aantal dagen cultuur gestopt in metafasestadium door
toevoeging van colcemide → inhibeert vorming v.d. mitotische spoelfiguur, waardoor
cellen niet voorbij metafase geeraken
▪ Vervolgens wordt een hypotone oplossing toegevoegd waardoor cel opzwelt zodat
chromosomen meer plaats krijgen om spreiden + celwand meer gespannen staat
▪ Daarna worden cellen in opgeblazen toestand gefixeerd door toeboegingn van fixatief
bestaande uit methanol + azijnzuur
▪ Dit fixatief verwijdert water uit cellen, doodt en bewaart cellen, verhardt het
membraan en het chromatine → hierdoor is kleuring van chromosomen mogelijk
3) Spreiden:
▪ Na fixatie worden geoogste cellen op objectglaasjes gedruppeld en onder specifieke
omstandigheden gedroogd → optimale spreiding van chromosomen te bekomen
4) Kleuring:
▪ Na differentiële kleuring kunnen constitutionele
chromosomale afwijkingen (numerieke en structurele
afwijkingen) worden opgespoord
▪ Door kleuring wordt bandenpatroon verkregen dat specifiek
is voor elk chromosoom
▪ Chromosoombanden worden genummerd vertrekkend vanaf
het centromeer tot aan het telomeer → per chromosoomarm
(korte arm = p-arm ; lange arm = q-arm)
▪ Locatie v.e. afwijking aan chromosoom kan hierdoor precies
beschreven worden
▪ Verschillende kleuringsmethodes:
3
, - Quinacrine-bandering (Q-bandering): eerste kleuringsmethode, gebruik
maken van quinacrine voor het bekomen van specifieke bandenpatronen,
wordt niet meer vaak gebruik vermits fluorescentiemicroscoop nodig
- Giemsa-bandering (G-bandering): meest gebruikte methode, hierbij
chromosomen eerst getrypsiniseer waarna Giemsa kleurstof wordt toegevoegd
- Reverse-bandering (R-bandering): wanneer chromosomen voor de kleuring
verhit worden, vertonen chromosomen een bandering die omgekeerd is aan
het bandenpatroon gegenereerd met Q-of G- bandering, vandaar de naam
- Ook nog andere kleuringstechnieken specifiek voor bepaalde delen van
chromosomen
5) Metafasen selecteren onder lichtmicroscoop:
▪ Metafasen onder lichtmiscroscoop (1000x vergroting) geteld en geanalyseerd worden
▪ Bij constitutionele indicaties minstens 2 metafasen onderzocht, bij verworven
aandoeningen standaard minstens 20 metafasen geanalyseerd
▪ Chromosomenkaarten kunnen vervolgens door computer gestuurde beeldanalyse
opgesteld worden
6) Het karyogram:
▪ Bij het opstellen van karyogram worden chromsomen eerst gesorteerd op grootte en
nadien volgens centromeerpositie
▪ Humane chromosomen geranschikt in 3 subtypes
volgens positie centromeer:
- Metacentrische chromosomen waarbij p en
q-armen ongeveer even groot zijn +
centromeer centraal ligt (chromosomen 1-
3)
- Submetacentrische chromosomen (4-12 en
16-20) waarbij p-arm korter is
- Acrocentrische chromosomen waarbij er
quasi geen p-arm is (13-15 en 21-22)
▪ Normaal karyogram bevat 22 paar autosomen en 2
geslachtschromosomen
▪ Genoteerd als karyotype: 46,XX (vrouw) en 46,XY (man)
▪ Bij analyse van karyogram wordt nagekeken of er numerieke of structurele
afwijkingen aanwezig zijn
▪ Bij numerieke afwijkingen noteert men aantal chromosomen en chromosoom dat te
vee of te weinig is, voorafgegaan door respectievelijke +/- (vb. 47,XX,+21)
▪ Ook structurele afwijkingen: deze worden onderverdeeld in gebalanceerde en
ongebalanceerde afwijkingen
- Gebalanceerde afwijkingen: geen netto verlies of winst van chromosomaal
materiaal
- Ongebalanceerde afwijkingen: wel verlies of winst chromosomaal materiaal
Belangrijkste gebalanceerde afwijkingen die aangetoond kunnen worden met karyotypering:
• Reciproke translocaties: chromosoomsegmenten uitgewisseld tussen 2 chromosomen, zonder
wijziging aantal chromosomen
→ notatie: t(chr1;chr2)(breukpuntchr1;breukpuntchr2)
4
