samenvatting gen en celtechnologie

Gen en celtechnologie
Antilichaam
- Opwekken in muis, kat, geiten, rat maar ookkamelen, lama en alpaca
- Synthetische peptiden, eiwitfragmenten, eiwitten= immunogeen= KLH= keyhole limpet
hemocyanine (peptiden binden aan KLH  makkelijker isoleren en zodat het niet snel wordt
uitgeplast (door uit te plassen= geen immuunreactie)
- Soms antilichaan tegen korte tag sequentie gebruikt ipv tegen antigen (cdna codeert voo eiwit
en er bestaat geen commericiele al hiervoor  via pcr ga je tag sequentie toevoegen 
overeenkomen met open reading frame zodat er geen stopcodon in zit  fusiegen en tegen
die tag bestaat er wel een al proberen om zo kort mogelijke sequentie zodat je zo weinig
mogelijk fouten maakt
Fusieprotein maken door tag met cdna in plasmide te brengen en transfecteren en zo tag aan
eiwit
- Nadeel: tag kan biologische functie van een eiwit beinvloeden
- Als je antistoffen hebt  affiniteitszuivering antilichamen  Western blotting, in situ,
immuno precipitatie
- !! het is niet omdat er een comercieel antilichaam bestaat dat het ook goed is
- Verschillende soorten antilichamen
o Conventionele antibody= kDa  Igg heeft twee zware en 2 lichte ketens
quaternaire structuur
o Lama heavy chain antibody  HcAb heft geen lichte kete, enkel 2 zware keten  1
ovaal=ig fold
o Nanobody= antigen binding fragement  verantwoordelijk voor interactie met ag
15kDA (120/130 az)
- IgG, scFv, VHH
o Fab  al zo kleine mogelijk
o Sommige grote al kunnen moeilijk door membraan penetreren  stukje weglaten
Je kan dit doen maar je bent beperkt
Je kan Fc gedeelte wegelaten en enkel FAB gebruiken of door constante gedeelte van
al gedeelte
!!! dit kan enkel als je het gekloneerd hebt
o scFV = Je hebt altijd twee domeinen nodig VH en VL je kan niet kleiner gaan
Deze twee domeinen interageren met elkaar met interface en binnenkant=
hydrofobe az= hydrofobe patch op interface openen = precipatie
Enkel
o lama igg heeft twee VHH en geen VL dus er is geen interface dus van lama al kan je
wel enkel VHH nemen= signle domein antibody
bij lama kan er geen lichte keten aangekoppeld worden want er is daar geen
connectie
VHH kan je vinden in lama, dromedaris, kameel, alpaca  ontdekt door raymond
hamers en serge muyldermans
Ook verplegsterhaai en tapijthaai hebben geen lichte keten  ipv twee vaste
doemienn en 1 variabelen zijn hebben 5 constante= VNAR

, - eigenschappen en enkele toepassingen van enkel keten antilichaam, nanobody, singel
domain antibodie, VHH
o VHH hebben betere oplosbaarheid
o Conventionele antistoffen als therapeuticum  complexe opbouw, groote,
immunogeniciteit
Fragementen Fab, scFv, VH, VL slecht oplosbaar
Antibodys kunnen zelf immunogeen worden antistoffen aanmaken tegen medicijn
o hcAB  geen CH1 of lichte keten
o hun VHH= makkelijk te clonen, robuust, actief en stabiel
VHH van kameel lijkt meer op VH van mens dan muis maar kunnen toch immunogene
reacties uitlokken
- structureel bestaan nanobodies uit alternering van framework region en complemntarity
deteriming regions (CDR) en zijn langer dan die van mens= + want flexibel en verschillende
conformaties ondergaan om zo in holte van enzyme terecht te komen  hoe langer CDR hoe
makkelijker in enzymatisch hole CDR's zijn de meest variabele delen van de
variabele regio's van antilichamen. Ze zijn verantwoordelijk voor het herkennen en
binden van specifieke antigenen
- VHH zijn hydrofober dan VH zie dia 12  dit gebeurt door zeer weinig wijzigingen
Het gezuiverde eiwit wordt geinjecteerd in het dier en het dier maakt antistoffen
aan
o Dus uit bloed word wbc gehaalt want maken al  uit wbc ga je
boodschapper rna halen (antistoffen gecodeerd door genen)
o De coderende sequentie voor VHH worden bepaald door 1 exon  dmv RT-
PCR en 2 oligonucleotiden zullen alle VHH sequenties omgezet worden naar
dna (om te kloneren en amplificeren)
o 10-100 miljoen verschillende vhh en er zijn er soms maar 10 die je wilt
hebben  faagpresentatie
Met faagmide = circulair sutkje dna en tergelijkertijd stukje van faag 
cdna in faagmide kloneren en die faagmide in bacterie brengen (VHH wordt
gecloneerd in faagmide)
Elke faag gaat op opp VHH
Het zijn manteleiwitten (Gen 3) die VHH gaan expresseren
Met elisa ga je binding tussen antigeen en antibody gaan meten in welplaat
en zo ga je fagen aarnijken
Faagmide haal je uit bacteriefooaag en dna sequentie wordt bepaald  als
bepaalde sequentie vaak terugkomen= specifieke binder
Eindresultaat: specifiek want herhalende sequenties zijn er uitgefilterd
Je krijgt onmiddellijk het dna en de aminozuursequentie
Belangrijkste waar je naar kijkt is CDR3  belangrijkste deel van VHH voor
binding met ag
En elke sequentie is anders dus kan je vermoeden dat nanobies op
vershcillende plaatsen van antigeen binden=> je kan eiwit opp aftasten
Tussen lama en muizen is anders  lamas lopen in de wei en muizen zitten
in labo dus lamas zijn niet allemaal gelijk aan elkaar= meer variatie in
sequentie van antistoffen
- Toepassing nanobodies
o Als tracer voor endogeen proteine overepressie is niet meer nodig, dus
gaat sneller
Endogeen eiwit ga je volgen met VHH  veel minder protein homeostase
beinvloeden