GEÏNTEGREERD
PRACTICUM:
MOLECULAIRE
BIOLOGIE EN
GENETICA
3e Bachelor Biomedische Wetenschappen
Universiteit Antwerpen
Gedoceerd door:
Eva Geuens
,EXPERIMENT 1: SEQUENCTIEBEPALING VAN EEN ONBEKEND GEN
1. DNA-EXTRACTIE UIT SPEEKSEL M.B.V. ZOUTPRECIPITATIE
- Vertrekken van eigen speeksel
- Verschillende mogelijkheden om DNA te extraheren
o IsolaKe kit met spinkolommen à kolommen blokkeren doordat er veel cellen verzameld worden
o Fenol-chloroform à fasescheiding tussen fenol, chloroform en water
§ ¹ veilig (toxisch, milieubelastend) product
o Extrac'e van DNA uit speeksel via zoutprecipita'e
§ Cellen intact collecteren à beetje ‘kauwen’ op wang + mond spoelen met fysiologische zoutoplossing
§ Hierna centrifugeren (om cellen te collecteren)
• Vaste hoek rotor: cellen tegen de kant worden gekatapulteerd, kans op breken
• Swinging bucket (swing out) rotor: sedimentaKeafstand is langer à veel minder cel lysis
§ Cellen (celmembraan (bevat lipiden)) met lysisbuffer openbreken
• Bufferende component: Tris
• EDTA, SDS (detergent: gaat cellen breken), NaCl
• Verwarmen zodat cellen goed kunnen breken
§ Volledige celinhoud (eiwi\en + DNA + lipiden …) komt vrij
• Enkel geïntresseerd in het DNA, niet in de eiwi\en (= contaminerende factor)
• PKA toevoegen à A`raak eiwi\en (‘stukknippen’)
• Nu zoutprecipitaKe (met verzadigd NaCl) à eiwi\en laten neerslaan
o Normaal: watermantel rondom de eiwi\en in de oplossing
o Door toevoegen zout (NaCl) zal ook rondom het zout een watermantel verschijnen
o CompeKKe tussen zout en eiwi\en voor watermantel
§ Zout zal uiteindelijk de watermantal van de eiwi\en on\rekken
§ Hierdoor slaan de eiwi\en neer
o Zout ¹ sterk genoeg om watermantel rondom DNA (sterk negaKef) te verbreken
§ DNA blija dus wel in de oplossing (supernatans)
o Door organisch solvent (ethanol): watermantel rondom DNA doorbreken
§ Mengen door 1 keer epje te kantelen
§ Idealiter in midden epje: viskeuze masse (‘sno\ebel’) + luchtbelletjes rond
§ Opvissen met glazen haakje (posiKeve lading zorgt dat DNA plakt)
§ DNA opnieuw oplossen in TE-4 buffer
2. CONCENTRATIEBEPALING M.B.V. SPECTROFOTOMETRIE
Van l-faag DNA wordt seriële verdunningsreeks gemaakt
- Via spectrofotometrie wordt vanuit verdunningen concentraKes gemeten
- Deze concentraKes uitze\en in grafiek (x = verdunning / y = concentraKe)
- Vanuit ijklijn van de grafiek kan dan de originele DNA-concentraKe van het l-faag DNA berekend worden (met x = 1)
Eigen DNA stalen ook in spectrofotometer
- DNA heea absorpKemaximum bij 260nm
o Voor dsDNA geldt: 1 OD260nm = 50 µg/ml (voor ssDNA of RNA geldt: 1 OD260nm = 40 µg/ml)
o A.d.h.v. de bekomen OD-waarde uit de spectrometrie kan dan zelf berekend worden wat de concentraKe is
- Controleren zuiverheid van de DNA stalen (contaminaKe van resterende eiwi\en in de oplossing uitsluiten)
o Eiwi\en hebben absorpKemaximum bij 280nm
o Verhouding (raKo) 260/280 wordt berekend (wel nog bepaalde absorpKe vd nucleoKden bij 280)
o Als dit getal zich tussen de range van 1,8 en 2,0 bevindt à zuiver DNA staal (>1,8: contaminaKe door eiwi\en)
- Spectrofotometer zet OD-waarden automaKsch om in concentraKe
o Deze waarden anders dan diegene die je zou bekomen door de 1 OD260nm = 50 µg/ml regel te gebruiken
o Spectrofotometer heea nog extra interne referenKe-, correcKemeKng, waardoor deze nauwkeuriger is!
1
, 3. CONTROLE DNA ZUIVERHEID EN CONCENTRATIE
Visueel kan ook concentraKe en zuiverheid gecontroleerd worden
- Kwaliteit van het DNA is belangrijk!
o Als DNA volledig gefragmenteerd is, zal er in de volgende stap (PCR) geen resultaat verkregen worden
Scheiding gebeurt m.b.v. agarose gelelektroforese
- Scheiding o.b.v. aantal bp in een elektrisch veld
o Kleine fragmenten migreren sneller doorheen de gel, grote blijven achter bovenaan de gel
- DNA is negaKef geladen à aangetrokken tot posiKeve pool (onderaan gel)
- Hoe hoger percentage vd agarosegel, hoe kleiner de poriën à hoe kleiner fragmenten die gescheiden kunnen scheiden
o Meestal tussen 0,8 en 2,0%
§ 0,8 – 1,0% = klein percentage à voor grote fragmenten (faag, eigen DNA) (1000bp – 30.000bp)
§ 1,0 – 1,5% = groot percentage à voor kleinere fragmenten (500bp – 10.000bp)
- Bovenaan de gel zou 1 duidelijk intens (fel) bandje zichtbaar moeten zijn (feller = hogere concentraKe)
o Indien bandje verspreid is over gel (bandjes bij veel verschillende moleculaire gewichten = smeer) zal het DNA
volledig gefragmenteerd zijn à niet goed
- Visualiseren van het DNA gebeurt met DNA intercalerende moleculen die in de agarosegel gepipe\eerd worden
o Gouden standaard = ethidiumbromide à zeer toxisch, mutageen
o Wij: GelRed = minder toxisch à gebruik handschoenen toch verplicht (ookal zegt fabrikant niet toxisch)
o Zal oplichten bij UV licht
4. PCR AMPLIFICATIE VOOR ONBEKENDE GEN
A LG E M E E N P R I N C I P E P C R
- Meestal reeks van 20-40 herhaalde temperatuurwisselingen (= thermische cycli genoemd)
- Gebruikte temperaturen en duur vd cycli arankelijk van verschillende parameters
o Enzym dat wordt gebruikt voor DNA-synthese à Taq polymerase
o De concentraKe tweewaardige ionen en dNTPs in de reacKe
o Smel\emperatuur (Tm) vd primers (primers moeten eerst ontwikkeld en besteld worden
Denatura'e:
- Verwarmen van de reacKekamer (94°C)
- Hierdoor denatureerd het DNA
o H-bruggen tussen complementaire basen te verbreken
o hierdoor ontstaan twee enkelstrengs DNA-strengen ontstaan.
2
PRACTICUM:
MOLECULAIRE
BIOLOGIE EN
GENETICA
3e Bachelor Biomedische Wetenschappen
Universiteit Antwerpen
Gedoceerd door:
Eva Geuens
,EXPERIMENT 1: SEQUENCTIEBEPALING VAN EEN ONBEKEND GEN
1. DNA-EXTRACTIE UIT SPEEKSEL M.B.V. ZOUTPRECIPITATIE
- Vertrekken van eigen speeksel
- Verschillende mogelijkheden om DNA te extraheren
o IsolaKe kit met spinkolommen à kolommen blokkeren doordat er veel cellen verzameld worden
o Fenol-chloroform à fasescheiding tussen fenol, chloroform en water
§ ¹ veilig (toxisch, milieubelastend) product
o Extrac'e van DNA uit speeksel via zoutprecipita'e
§ Cellen intact collecteren à beetje ‘kauwen’ op wang + mond spoelen met fysiologische zoutoplossing
§ Hierna centrifugeren (om cellen te collecteren)
• Vaste hoek rotor: cellen tegen de kant worden gekatapulteerd, kans op breken
• Swinging bucket (swing out) rotor: sedimentaKeafstand is langer à veel minder cel lysis
§ Cellen (celmembraan (bevat lipiden)) met lysisbuffer openbreken
• Bufferende component: Tris
• EDTA, SDS (detergent: gaat cellen breken), NaCl
• Verwarmen zodat cellen goed kunnen breken
§ Volledige celinhoud (eiwi\en + DNA + lipiden …) komt vrij
• Enkel geïntresseerd in het DNA, niet in de eiwi\en (= contaminerende factor)
• PKA toevoegen à A`raak eiwi\en (‘stukknippen’)
• Nu zoutprecipitaKe (met verzadigd NaCl) à eiwi\en laten neerslaan
o Normaal: watermantel rondom de eiwi\en in de oplossing
o Door toevoegen zout (NaCl) zal ook rondom het zout een watermantel verschijnen
o CompeKKe tussen zout en eiwi\en voor watermantel
§ Zout zal uiteindelijk de watermantal van de eiwi\en on\rekken
§ Hierdoor slaan de eiwi\en neer
o Zout ¹ sterk genoeg om watermantel rondom DNA (sterk negaKef) te verbreken
§ DNA blija dus wel in de oplossing (supernatans)
o Door organisch solvent (ethanol): watermantel rondom DNA doorbreken
§ Mengen door 1 keer epje te kantelen
§ Idealiter in midden epje: viskeuze masse (‘sno\ebel’) + luchtbelletjes rond
§ Opvissen met glazen haakje (posiKeve lading zorgt dat DNA plakt)
§ DNA opnieuw oplossen in TE-4 buffer
2. CONCENTRATIEBEPALING M.B.V. SPECTROFOTOMETRIE
Van l-faag DNA wordt seriële verdunningsreeks gemaakt
- Via spectrofotometrie wordt vanuit verdunningen concentraKes gemeten
- Deze concentraKes uitze\en in grafiek (x = verdunning / y = concentraKe)
- Vanuit ijklijn van de grafiek kan dan de originele DNA-concentraKe van het l-faag DNA berekend worden (met x = 1)
Eigen DNA stalen ook in spectrofotometer
- DNA heea absorpKemaximum bij 260nm
o Voor dsDNA geldt: 1 OD260nm = 50 µg/ml (voor ssDNA of RNA geldt: 1 OD260nm = 40 µg/ml)
o A.d.h.v. de bekomen OD-waarde uit de spectrometrie kan dan zelf berekend worden wat de concentraKe is
- Controleren zuiverheid van de DNA stalen (contaminaKe van resterende eiwi\en in de oplossing uitsluiten)
o Eiwi\en hebben absorpKemaximum bij 280nm
o Verhouding (raKo) 260/280 wordt berekend (wel nog bepaalde absorpKe vd nucleoKden bij 280)
o Als dit getal zich tussen de range van 1,8 en 2,0 bevindt à zuiver DNA staal (>1,8: contaminaKe door eiwi\en)
- Spectrofotometer zet OD-waarden automaKsch om in concentraKe
o Deze waarden anders dan diegene die je zou bekomen door de 1 OD260nm = 50 µg/ml regel te gebruiken
o Spectrofotometer heea nog extra interne referenKe-, correcKemeKng, waardoor deze nauwkeuriger is!
1
, 3. CONTROLE DNA ZUIVERHEID EN CONCENTRATIE
Visueel kan ook concentraKe en zuiverheid gecontroleerd worden
- Kwaliteit van het DNA is belangrijk!
o Als DNA volledig gefragmenteerd is, zal er in de volgende stap (PCR) geen resultaat verkregen worden
Scheiding gebeurt m.b.v. agarose gelelektroforese
- Scheiding o.b.v. aantal bp in een elektrisch veld
o Kleine fragmenten migreren sneller doorheen de gel, grote blijven achter bovenaan de gel
- DNA is negaKef geladen à aangetrokken tot posiKeve pool (onderaan gel)
- Hoe hoger percentage vd agarosegel, hoe kleiner de poriën à hoe kleiner fragmenten die gescheiden kunnen scheiden
o Meestal tussen 0,8 en 2,0%
§ 0,8 – 1,0% = klein percentage à voor grote fragmenten (faag, eigen DNA) (1000bp – 30.000bp)
§ 1,0 – 1,5% = groot percentage à voor kleinere fragmenten (500bp – 10.000bp)
- Bovenaan de gel zou 1 duidelijk intens (fel) bandje zichtbaar moeten zijn (feller = hogere concentraKe)
o Indien bandje verspreid is over gel (bandjes bij veel verschillende moleculaire gewichten = smeer) zal het DNA
volledig gefragmenteerd zijn à niet goed
- Visualiseren van het DNA gebeurt met DNA intercalerende moleculen die in de agarosegel gepipe\eerd worden
o Gouden standaard = ethidiumbromide à zeer toxisch, mutageen
o Wij: GelRed = minder toxisch à gebruik handschoenen toch verplicht (ookal zegt fabrikant niet toxisch)
o Zal oplichten bij UV licht
4. PCR AMPLIFICATIE VOOR ONBEKENDE GEN
A LG E M E E N P R I N C I P E P C R
- Meestal reeks van 20-40 herhaalde temperatuurwisselingen (= thermische cycli genoemd)
- Gebruikte temperaturen en duur vd cycli arankelijk van verschillende parameters
o Enzym dat wordt gebruikt voor DNA-synthese à Taq polymerase
o De concentraKe tweewaardige ionen en dNTPs in de reacKe
o Smel\emperatuur (Tm) vd primers (primers moeten eerst ontwikkeld en besteld worden
Denatura'e:
- Verwarmen van de reacKekamer (94°C)
- Hierdoor denatureerd het DNA
o H-bruggen tussen complementaire basen te verbreken
o hierdoor ontstaan twee enkelstrengs DNA-strengen ontstaan.
2
