ANALYTISCHE
BIOCHEMIE 1
Scheiding en zuivering van biomoleculen
2e Bachelor Biomedische wetenschappen
2e Bachelor Biochemie en Biotechnologie
Universiteit Antwerpen
,Algemene inleiding
INLEIDING
DOEL VAN DE BIOCHEMISCHE ANALYSE
Biochemie = studie van chemische processen in levende organismen met als doel het begrijpen van het moleculaire
werkingsmechanisme van de cel
In vitro is het interpreteren eenvoudiger, maar deze situaIe komt minder goed overeen met de fysiologische situaIe in vivo.
- Het effect op een celcultuur zegt niet veel over het effect in het levend organisme (effecten kunnen verschillen)
Technieken die hierbij aan bod komen, omvaQen:
1) Staalvoorbereiding
2) Zuivering en isolatie van biocomponenten uit dit staal
3) Identificatie, karakterisatie en eventueel ook kwantificatie van deze biocomponenten.
DESIGN VAN EEN BIOCHEMISCH EXPERIMENT
1) Identificatie vh onderwerp: wat willen we onderzoeken?
2) Literatuuronderzoek: wat is er al geweten over dit onderwerp/methodes (sterktes, zwaktes)
3) Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4) Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5) Welke variabele bestuderen we + controle omgevingsparameters (hoe zorgen dat alle andere parameters stabiel zijn?)
6) Design vh experiment (materialen, apparatuur, calibraties, controles, kostprijs, veiligheidsvoorschriften,..)
7) Uitvoering experiment met inbegrip van passende calibraties en controles / zo reproduceerbaar mogelijk
8) Analyse van de resultaten, eventueel met gebruik van statistische testen
9) Formulering van de belangrijkste conclusies die uit de resultaten kunnen getrokken worden
10) Formulering van nieuwe hopthesen en toekomstige experimenten die voortvloeien uit de studie
CONTROLES
- Notities nemen doorheen het ganse proces is noodzakelijk!
- Zonder controles is het experiment waardeloos!
Posi+eve controle: nagaan of het testsysteem werkt.
- Belangrijk wanneer resultaat negatief is.
- Bv. Toevoegen van primair en secundair Ab op een plaats waar 100% zeker het Ag (eiwit) aanwezig is
o Als het resultaat dan toch negatief is, weet je dat het testsysteem niet werk
Nega+eve controle: nagaan of het resultaat alleen het gevolg is van de test
- Belangrijk wanneer resultaat positief is.
- Bv. Aspecifieke binding nagaan: enkel secundair Ab toevoegen, om te zien of het niet met andere eiwitten reageert
o Indien het resultaat dan toch positief is, dan weet je dat er aspecifieke binding is
Andere controles: bv. op parameters die moeilijk gelijk te houden zijn, vergelijking met andere stalen, voor normalisaIe (bv. met
zelfde experiment dat wordt uitgevoerd op ander IjdsIp), etc.
MEETEENHEDEN
SI Units (Système InternaIonales d’Unités): algemeen aanvaarde eenheden.
- Deze kunnen geconverteerd worden naar andere units of door conversie uit andere units verkregen worden.
1
,OPLOSSING
= homogeen mengsel van een of meerdere substanIes (solute) in een vloeibare component (solvent (vaak H2O))
CONCENTRATIES
De concentraIe geem de hoeveelheid weer van elke substanIe in een bepaalde hoeveelheid solvent (gewicht of volume)
- Gewoonlijk weight/volume (w/v) (g/l) soms volume/volume (v/v) of weight/weight (w/w)
- In percentage; vb. 1% NaCl oplossing (w/v) = 1g NaCl in 100 cm3 of 100 ml water
- Parts per milion (ppm) =106
- part per bilion (ppb)= 109 (kan zowel gram per gram of cm3)
vb. Lucht bevat 8ppm CO Þ 8cm3 CO per 106 cm3 lucht
vb. 1 g water = 1 cm3 = 1 ml ® 1 kg = 1 dm3 = 1 l
MOLARITEIT
"#!
1 atomic mass unit of 1 dalton = massa van = 1,660539. 10-24 g
"#
Atomaire massa = massa van 1 molecule van die stof uitgedrukt in dalton (vb. atomaire massa HCl = 36,46 dalton)
1 mol = de hoeveelheid van de substanIe die 6,022 x 1023 moleculen bevat (getal van Avogadro of NA)
Moleculaire massa (MW) = de atomaire massa * 1g/mol (dus MW HCl = 36,45 g/mol)
$
$ &!'
Molariteit van een oplossing = aantal g / moleculair gewicht (vb. $(,*(% +/-.' = 0,08 mol/l of M
SI voor concentraIe is eigenlijk mol/m3 maar voor biochemische toepassingen
mol/dm3 = mol/l = molariteit (M)
VERDUNNINGEN
Verdunningen maakt men uit hogere geconcentreerde oplossingen, een oplossing creëren met een lagere concentraIe:
m1.V1 = m2.V2
Zie oefeningen slides 33-36!! (EX!!)
IONISCHE STERKTE (µ OF I)
Ionisa+e = het uiteenvallen van ionen in een waterige oplossing
- Sterke elektrolyten: irreversibele ionisatie, atomen door ionische bindingen bij elkaar gehouden (Na en Cl in een kristal)
- Zwakke elektrolyten: reversibele ionisatie, moleculen die partieel geladen zijn en dmv hun positie ionisatie kunnen
stimuleren (vb H2O)
- Non- elektrolyten: geen ionisatie (vb. glucose)
Hoeveelheid individuele ionen (zowel sterke- als zwakke elektrolyten worden gebruikt) meten in een oplossing:
- μ = 1⁄2 ∑cnzn2 c = concentratie in M z = lading individuele ionen.
2
, Zouten die divalente ionen vormen (vb. MgSO4 ® Mg2+ + SO42- ) vertonen ionpairing:
- ionen tot elkaar aangetrokken in waterige oplossing zodat ze toch ionbinding in water vormen
- MgSO4 ioniseert voor 65% in water
Ionen worden omgeven door tegenionen (kan ook water zijn vanwege zijn polair karakter) die zorgen voor een reducIe van de
effecIeve lading op het centrale ion. Dit vergroot bij verhoogd ionsterkte.
ACTIVITEIT EN ACTIVITEITSCOËFFICIËNT
- Aanwezigheid van zouten in oplossing à verhoging van dissociaIe van zwakke electrolieten
- Ionen zijn immers geladen en interageren in oplossing met zouten à elkaar aantrekken en/of afstoten
- Door deze interacIe worden de ionen afgeschermd à daling van de effecIeve concentraIe!
- Daarom: acIviteit gebruiken (= effecIeve concentraIe)
M.a.w. de ionische sterkte beïnvloedt de effecIeve concentraIe van een ioniseerbare stof waarbij de effecIeve concentraIe
(‘AcIvity’ of A) in verband staat met de nominale concentraIe door een factor welke we de acIviteitscoëfficiënt noemen (γ):
Ax = [X] γx
Waarbij AX de acIviteit van de stof X is, [X] de nominale concentraIe van X en γx de acIviteitscoëfficiënt van X.
- AcIviteitscoëfficiënt is dus maat voor afwijking vh ionisaIegedrag van de stof als gevolg van de ionische sterkte.
- Merk op dat wanneer µ sIjgt, γx daalt, waardoor de acIviteit daalt relaIef tegenover de concentraIe van het product
(zie tabel slide 55!)
- In het algemeen zijn de concentraIes bij biochemische experimenten vrij laag zodat acIviteit en concentraIe nagenoeg
samenvallen maar indien nodig kan γx uit tabellen bekomen worden
Zwakke elektrolyten: Biochemische funcIe is a{ankelijk van de precieze staat van ionisaIe bij een bepaalde pH in een bepaalde
cellulaire context.
IonisaIe van water: H2O ↔ OH- + H+ (Eq= 1.8 x10-16 bij 24°C) molarieit van H2O = 55,6M
- 1.8 x10-16 x 55.6 = [H+][OH-] = 1.0 x10-14 = KW (autoprotolyse constante van water)
- pH = -log [H+] en bij 24°C neemt deze een waarde aan die ongeveer gelijk is aan 7
OEFENING:
Er wordt een zout (0.1M NaCl) toegevoegd aan water waardoor de acIviteitscoëfficiënt van H+ en OH- daalt naar 0.83 en 0.76
waardoor de nominale concentraIes ook veranderen.
- KW = 1.0 x10-14 = [H+]0.83 X [OH-]0.76 ® [H+][OH-] = 1.59 x10-14
- [H+] = [OH-] = 1,26 x10-7 dit is een 26% verhoging tov 0M NaCl
ACTIVITEIT VAN [H+]:
- [H+]= 1,26 x10-7 x 0.83 = 1.05 x10-7 M dit is een 5% verhoging tov 0M NaCl
- pH = -log [H+] = -log [1.05 x10-7 M] = 6.90
3
BIOCHEMIE 1
Scheiding en zuivering van biomoleculen
2e Bachelor Biomedische wetenschappen
2e Bachelor Biochemie en Biotechnologie
Universiteit Antwerpen
,Algemene inleiding
INLEIDING
DOEL VAN DE BIOCHEMISCHE ANALYSE
Biochemie = studie van chemische processen in levende organismen met als doel het begrijpen van het moleculaire
werkingsmechanisme van de cel
In vitro is het interpreteren eenvoudiger, maar deze situaIe komt minder goed overeen met de fysiologische situaIe in vivo.
- Het effect op een celcultuur zegt niet veel over het effect in het levend organisme (effecten kunnen verschillen)
Technieken die hierbij aan bod komen, omvaQen:
1) Staalvoorbereiding
2) Zuivering en isolatie van biocomponenten uit dit staal
3) Identificatie, karakterisatie en eventueel ook kwantificatie van deze biocomponenten.
DESIGN VAN EEN BIOCHEMISCH EXPERIMENT
1) Identificatie vh onderwerp: wat willen we onderzoeken?
2) Literatuuronderzoek: wat is er al geweten over dit onderwerp/methodes (sterktes, zwaktes)
3) Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4) Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5) Welke variabele bestuderen we + controle omgevingsparameters (hoe zorgen dat alle andere parameters stabiel zijn?)
6) Design vh experiment (materialen, apparatuur, calibraties, controles, kostprijs, veiligheidsvoorschriften,..)
7) Uitvoering experiment met inbegrip van passende calibraties en controles / zo reproduceerbaar mogelijk
8) Analyse van de resultaten, eventueel met gebruik van statistische testen
9) Formulering van de belangrijkste conclusies die uit de resultaten kunnen getrokken worden
10) Formulering van nieuwe hopthesen en toekomstige experimenten die voortvloeien uit de studie
CONTROLES
- Notities nemen doorheen het ganse proces is noodzakelijk!
- Zonder controles is het experiment waardeloos!
Posi+eve controle: nagaan of het testsysteem werkt.
- Belangrijk wanneer resultaat negatief is.
- Bv. Toevoegen van primair en secundair Ab op een plaats waar 100% zeker het Ag (eiwit) aanwezig is
o Als het resultaat dan toch negatief is, weet je dat het testsysteem niet werk
Nega+eve controle: nagaan of het resultaat alleen het gevolg is van de test
- Belangrijk wanneer resultaat positief is.
- Bv. Aspecifieke binding nagaan: enkel secundair Ab toevoegen, om te zien of het niet met andere eiwitten reageert
o Indien het resultaat dan toch positief is, dan weet je dat er aspecifieke binding is
Andere controles: bv. op parameters die moeilijk gelijk te houden zijn, vergelijking met andere stalen, voor normalisaIe (bv. met
zelfde experiment dat wordt uitgevoerd op ander IjdsIp), etc.
MEETEENHEDEN
SI Units (Système InternaIonales d’Unités): algemeen aanvaarde eenheden.
- Deze kunnen geconverteerd worden naar andere units of door conversie uit andere units verkregen worden.
1
,OPLOSSING
= homogeen mengsel van een of meerdere substanIes (solute) in een vloeibare component (solvent (vaak H2O))
CONCENTRATIES
De concentraIe geem de hoeveelheid weer van elke substanIe in een bepaalde hoeveelheid solvent (gewicht of volume)
- Gewoonlijk weight/volume (w/v) (g/l) soms volume/volume (v/v) of weight/weight (w/w)
- In percentage; vb. 1% NaCl oplossing (w/v) = 1g NaCl in 100 cm3 of 100 ml water
- Parts per milion (ppm) =106
- part per bilion (ppb)= 109 (kan zowel gram per gram of cm3)
vb. Lucht bevat 8ppm CO Þ 8cm3 CO per 106 cm3 lucht
vb. 1 g water = 1 cm3 = 1 ml ® 1 kg = 1 dm3 = 1 l
MOLARITEIT
"#!
1 atomic mass unit of 1 dalton = massa van = 1,660539. 10-24 g
"#
Atomaire massa = massa van 1 molecule van die stof uitgedrukt in dalton (vb. atomaire massa HCl = 36,46 dalton)
1 mol = de hoeveelheid van de substanIe die 6,022 x 1023 moleculen bevat (getal van Avogadro of NA)
Moleculaire massa (MW) = de atomaire massa * 1g/mol (dus MW HCl = 36,45 g/mol)
$
$ &!'
Molariteit van een oplossing = aantal g / moleculair gewicht (vb. $(,*(% +/-.' = 0,08 mol/l of M
SI voor concentraIe is eigenlijk mol/m3 maar voor biochemische toepassingen
mol/dm3 = mol/l = molariteit (M)
VERDUNNINGEN
Verdunningen maakt men uit hogere geconcentreerde oplossingen, een oplossing creëren met een lagere concentraIe:
m1.V1 = m2.V2
Zie oefeningen slides 33-36!! (EX!!)
IONISCHE STERKTE (µ OF I)
Ionisa+e = het uiteenvallen van ionen in een waterige oplossing
- Sterke elektrolyten: irreversibele ionisatie, atomen door ionische bindingen bij elkaar gehouden (Na en Cl in een kristal)
- Zwakke elektrolyten: reversibele ionisatie, moleculen die partieel geladen zijn en dmv hun positie ionisatie kunnen
stimuleren (vb H2O)
- Non- elektrolyten: geen ionisatie (vb. glucose)
Hoeveelheid individuele ionen (zowel sterke- als zwakke elektrolyten worden gebruikt) meten in een oplossing:
- μ = 1⁄2 ∑cnzn2 c = concentratie in M z = lading individuele ionen.
2
, Zouten die divalente ionen vormen (vb. MgSO4 ® Mg2+ + SO42- ) vertonen ionpairing:
- ionen tot elkaar aangetrokken in waterige oplossing zodat ze toch ionbinding in water vormen
- MgSO4 ioniseert voor 65% in water
Ionen worden omgeven door tegenionen (kan ook water zijn vanwege zijn polair karakter) die zorgen voor een reducIe van de
effecIeve lading op het centrale ion. Dit vergroot bij verhoogd ionsterkte.
ACTIVITEIT EN ACTIVITEITSCOËFFICIËNT
- Aanwezigheid van zouten in oplossing à verhoging van dissociaIe van zwakke electrolieten
- Ionen zijn immers geladen en interageren in oplossing met zouten à elkaar aantrekken en/of afstoten
- Door deze interacIe worden de ionen afgeschermd à daling van de effecIeve concentraIe!
- Daarom: acIviteit gebruiken (= effecIeve concentraIe)
M.a.w. de ionische sterkte beïnvloedt de effecIeve concentraIe van een ioniseerbare stof waarbij de effecIeve concentraIe
(‘AcIvity’ of A) in verband staat met de nominale concentraIe door een factor welke we de acIviteitscoëfficiënt noemen (γ):
Ax = [X] γx
Waarbij AX de acIviteit van de stof X is, [X] de nominale concentraIe van X en γx de acIviteitscoëfficiënt van X.
- AcIviteitscoëfficiënt is dus maat voor afwijking vh ionisaIegedrag van de stof als gevolg van de ionische sterkte.
- Merk op dat wanneer µ sIjgt, γx daalt, waardoor de acIviteit daalt relaIef tegenover de concentraIe van het product
(zie tabel slide 55!)
- In het algemeen zijn de concentraIes bij biochemische experimenten vrij laag zodat acIviteit en concentraIe nagenoeg
samenvallen maar indien nodig kan γx uit tabellen bekomen worden
Zwakke elektrolyten: Biochemische funcIe is a{ankelijk van de precieze staat van ionisaIe bij een bepaalde pH in een bepaalde
cellulaire context.
IonisaIe van water: H2O ↔ OH- + H+ (Eq= 1.8 x10-16 bij 24°C) molarieit van H2O = 55,6M
- 1.8 x10-16 x 55.6 = [H+][OH-] = 1.0 x10-14 = KW (autoprotolyse constante van water)
- pH = -log [H+] en bij 24°C neemt deze een waarde aan die ongeveer gelijk is aan 7
OEFENING:
Er wordt een zout (0.1M NaCl) toegevoegd aan water waardoor de acIviteitscoëfficiënt van H+ en OH- daalt naar 0.83 en 0.76
waardoor de nominale concentraIes ook veranderen.
- KW = 1.0 x10-14 = [H+]0.83 X [OH-]0.76 ® [H+][OH-] = 1.59 x10-14
- [H+] = [OH-] = 1,26 x10-7 dit is een 26% verhoging tov 0M NaCl
ACTIVITEIT VAN [H+]:
- [H+]= 1,26 x10-7 x 0.83 = 1.05 x10-7 M dit is een 5% verhoging tov 0M NaCl
- pH = -log [H+] = -log [1.05 x10-7 M] = 6.90
3
